張 臻，闕華發(fā)

糖尿病潰瘍是糖尿病常見(jiàn)而又嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，往往遷延難愈，并且極易復(fù)發(fā)。在創(chuàng)傷愈合過(guò)程中，炎癥反應(yīng)是創(chuàng)面修復(fù)的重要內(nèi)容，為后續(xù)的修復(fù)或再生奠定了重要基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)擬觀察糖尿病性創(chuàng)面與正常創(chuàng)面在創(chuàng)傷愈合過(guò)程中不同時(shí)期炎癥相關(guān)因子的動(dòng)態(tài)變化的差異性，探討影響糖尿病潰瘍愈合的因素，為糖尿病性潰瘍的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3月齡SPF級(jí)雄性SD大鼠40只（上海畢凱醫(yī)藥科技有限公司提供，合格證編號(hào)：20180006007335），體質(zhì)量 200～230 g。

1.2 主要試劑與儀器 白細(xì)胞介素（IL）-1β抗體（ab9722），工作濃度 1∶500 ；IL-6 抗體（ab9324），工作濃度1∶500；IL-10抗體（ab192271），工作濃度 1∶200 ；腫瘤壞死因子（TNF）-α 抗體（ab1793），工作濃度1∶100，以上抗體均購(gòu)自美國(guó)abcam公司；病理切片機(jī)（RM2016），購(gòu)自上海徠卡儀器有限公司；組織攤片機(jī)（KD-P），購(gòu)自浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；多功能化學(xué)發(fā)光成像儀（620028-08Q），購(gòu)自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.3 糖尿病潰瘍大鼠模型建立 實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，定量飲水。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日稱體重，尾靜脈采血和收集尿液，用血糖儀和試紙法分別測(cè)定基礎(chǔ)血糖和尿糖，然后以pH值4.6，0.1 mmol/L的枸櫞酸鈉緩沖液溶解鏈脲佐菌素(STZ)，配成1%溶液，以60 mg/kg劑量單次腹腔內(nèi)注射STZ溶液，48 h后動(dòng)物血糖濃度＞16.65 mmol/L及尿糖為4個(gè)“＋”時(shí)，即制成糖尿病鼠模型[1]。監(jiān)測(cè)血糖，若血糖高于30 mmol/L，根據(jù)所測(cè)得的血糖水平，皮下注射胰島素(2～4 U)/只，1次/d。飼養(yǎng)8周后，將糖尿病模型大鼠用電動(dòng)剃毛器將大鼠背部毛發(fā)去除干凈，隨后以7%的水合氯醛（按1 mL/200 g麻醉劑量）腹腔注射麻醉，麻醉滿意后，以呋喃西林消毒背部皮膚，在無(wú)菌條件下用外科方法作2個(gè)深達(dá)深筋膜、直徑為1 cm的全層皮膚缺損，即制成糖尿病潰瘍模型[2]。

1.4 分組與給藥 將40只大鼠隨機(jī)均分為正常組及糖尿病潰瘍模型組。所有大鼠均用外科手術(shù)方法制作背部全層皮膚缺損模型。各組于創(chuàng)面造模后當(dāng)日開(kāi)始給藥，換藥前均以1/5000呋喃西林溶液清潔創(chuàng)面，外敷生理鹽水紗布，外用兩層消毒干紗布覆蓋固定，每天換藥、灌胃1次。

1.5 檢測(cè)指標(biāo) 分別于術(shù)后第3天（炎癥期）、第10天（增殖期），將大鼠腹腔注射7%的水合氯醛麻醉，創(chuàng)面消毒后，用外科手法剪取創(chuàng)面肉芽組織，以4%多聚甲醛固定，用免疫熒光法測(cè)定M1、M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量，免疫組化圖像分析法檢測(cè)IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10的表達(dá)水平。

1.6 檢測(cè)方法 （1）免疫熒光：石蠟切片常規(guī)脫蠟、復(fù)水、抗原修復(fù)；用PBS清洗3次，每次5 min，1%BSA濕盒中室溫封閉30 min，滴加1%BSA稀釋的一抗混合液（CD163+CD68；CD86+CD68），濕盒中4℃冰箱孵育過(guò)夜，用PBS清洗3次，每次5 min，滴加PBS稀釋的熒光二抗（1∶200），濕盒中37℃孵育50 min，PBS清洗3次，每次5 min，DAPI復(fù)染，PBS清洗3次，每次5 min，滴加2 μL的抗熒光猝滅液，封片，鏡檢。（2）免疫組化圖像分析：每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)抽取6個(gè)標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)樣本，石蠟切片常規(guī)脫蠟，PBS清洗3次，每次5 min，向組織區(qū)域滴加1%BSA，室溫濕盒封閉30 min，向組織區(qū)域滴加稀釋后一抗溶液，4℃孵育過(guò)夜，PBS清洗3次，每次5 min，滴加二抗，37℃孵育50 min，用PBS清洗3次，每次5 min，滴加DAB工作液，濕盒孵育20～40 s，顯微鏡下檢測(cè)染色程度，PBS清洗3次，每次5 min，蘇木素復(fù)染6 min，水洗，吹干，樹(shù)脂封片。通過(guò)顯微鏡、圖像采集卡、數(shù)碼相機(jī)采集數(shù)字圖像，放大倍數(shù)為400倍，讀取面積百分比值。每張照片隨機(jī)選取3個(gè)視野，取面積百分比的均值為各炎性因子的表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，最終數(shù)據(jù)均以表示。正常組與糖尿病潰瘍模型組間對(duì)比用兩樣本獨(dú)立t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖尿病創(chuàng)面和正常創(chuàng)面不同時(shí)期M1、M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量的比較 免疫熒光檢測(cè)創(chuàng)面M1和M2型巨噬細(xì)胞的表達(dá)水平，以CD68和CD86雙標(biāo)代表M1型巨噬細(xì)胞；CD68和CD163雙標(biāo)代表M2型巨噬細(xì)胞。第3天，糖尿病潰瘍模型組M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯減少，而M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)無(wú)明顯差別；第10天，兩組M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量區(qū)別不明顯，糖尿病潰瘍模型組M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯減少（圖1～4）。

圖1 創(chuàng)面第3天M1型巨噬細(xì)胞（CD68和CD86共表達(dá)）

圖2 創(chuàng)面第3天M2型巨噬細(xì)胞（CD68和CD163共表達(dá)）

圖3 創(chuàng)面第10天M1型巨噬細(xì)胞（CD68和CD86共表達(dá)）

圖4 創(chuàng)面第10天M2型巨噬細(xì)胞（CD68和CD163共表達(dá)）

2.2 糖尿病創(chuàng)面和正常創(chuàng)面炎癥因子在不同時(shí)期的動(dòng)態(tài)變化 正常組創(chuàng)面，增殖期IL-1β、IL-6的表達(dá)水平低于炎癥期，IL-10水平高于炎癥期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TNF-α表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。糖尿病潰瘍模型組創(chuàng)面，增殖期的IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10水平均高于炎癥期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1、2。

表1 正常組促炎因子在不同時(shí)期的動(dòng)態(tài)變化

表2 糖尿病潰瘍模型組促炎因子在不同時(shí)期的動(dòng)態(tài)變化

3 討論

創(chuàng)面修復(fù)是一個(gè)連續(xù)的復(fù)雜過(guò)程，包括炎癥期、增殖期和重塑期。炎癥期的病理過(guò)程主要包括單核/巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等向創(chuàng)傷處遷移，同時(shí)釋放多種炎癥相關(guān)因子。增殖期由成纖維細(xì)胞和新生毛細(xì)血管網(wǎng)形成肉芽組織,填充局部的組織缺損,繼而出現(xiàn)表皮細(xì)胞增殖，實(shí)現(xiàn)上皮重建。后期重塑期則包括成纖維細(xì)胞的繼續(xù)增殖和以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)的沉積[3-4]。其中，炎癥反應(yīng)是創(chuàng)面修復(fù)的第一階段，為后續(xù)的修復(fù)或再生奠定了重要基礎(chǔ)，炎癥階段到修復(fù)重塑階段的轉(zhuǎn)變是創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵，肉芽組織形成和上皮新生是創(chuàng)面修復(fù)愈合和組織再生過(guò)程中的重要內(nèi)容。

現(xiàn)代病理學(xué)和有關(guān)大鼠創(chuàng)面愈合的前期基礎(chǔ)研究認(rèn)為，創(chuàng)傷后第3天前后是創(chuàng)面修復(fù)的第一階段，是重要的炎癥反應(yīng)期，第10天前后是創(chuàng)面愈合后期重要的增殖階段[5-6]。清除損傷組織和控制感染是炎癥期重要的生理病理反應(yīng)，大量單核細(xì)胞趨化到創(chuàng)傷局部，同時(shí)轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，與存在于中性白細(xì)胞中的彈性硬蛋白酶、膠原酶等眾多蛋白酶家族一起協(xié)同作用，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能，使壞死組織溶解,組織膠原纖維分解，吞噬微生物及異物、變性組織。巨噬細(xì)胞包括M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞，作為傷口愈合過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素，它們?cè)趧?chuàng)面的愈合中扮演了兩種不同的角色，且一定程度上起到相反的作用，即M1型巨噬細(xì)胞促進(jìn)炎性反應(yīng)，而M2型巨噬細(xì)胞抑制炎性反應(yīng)[7-8]。創(chuàng)面的炎性反應(yīng)包括炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)及炎性因子的釋放。其中，IL-1、IL-6、TNF-α由活化的M1型巨噬細(xì)胞合成分泌，是重要的促炎因子，是感染或局部創(chuàng)傷后機(jī)體最早產(chǎn)生的多功能細(xì)胞因子之一。促炎因子的表達(dá)，能促進(jìn)發(fā)揮吞噬細(xì)胞碎片、清除病原體的炎癥反應(yīng)，但在此過(guò)程中正常機(jī)體組織亦有受M1型巨噬細(xì)胞或過(guò)度炎癥反應(yīng)破壞的可能。同時(shí)，IL-6在一定程度上還能促進(jìn)成纖維細(xì)胞遷移及膠原表達(dá)，因此在創(chuàng)傷早期可能有助于創(chuàng)傷愈合，但長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)高表達(dá)可能與纖維化即瘢痕形成有關(guān)。IL-10作為重要的抑炎因子，主要由M2型巨噬細(xì)胞促進(jìn)其高分泌，能起到針對(duì)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的減活化作用，從而弱化其分泌促炎細(xì)胞的功能[9]，具有抑制炎性反應(yīng)的作用。并且，在創(chuàng)面炎癥后期的轉(zhuǎn)歸階段，巨噬細(xì)胞還能及時(shí)清除一定數(shù)量的中性粒細(xì)胞，從而避免過(guò)度的炎癥反應(yīng)對(duì)周圍組織和細(xì)胞造成損傷。同時(shí)，M2型巨噬細(xì)胞還有著重要的促重塑作用，及促成纖維細(xì)胞遷移的作用。隨著進(jìn)入創(chuàng)面愈合的增殖階段，組織開(kāi)始修復(fù)，M2型巨噬細(xì)胞能恢復(fù)組織的穩(wěn)態(tài)和平衡，合成膠原蛋白，分泌高水平的生長(zhǎng)因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β)等，有助于成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等的遷移和增殖、肉芽組織形成和血管生成，進(jìn)而填補(bǔ)組織的缺損[10-11]，加速創(chuàng)面的愈合和組織重塑，并且還能調(diào)節(jié)肌成纖維細(xì)胞的分化與凋亡等途徑來(lái)減少纖維化，也就是在一定程度上抑制瘢痕的形成。研究證實(shí)由經(jīng)典途徑激活，并募集而來(lái)的巨噬細(xì)胞還可以轉(zhuǎn)變成替代性途徑活化的巨噬細(xì)胞，也就是M1型巨噬細(xì)胞可以向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變[12]。巨噬細(xì)胞的數(shù)量過(guò)多，存在時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，或表型轉(zhuǎn)變不及時(shí)，都可能影響創(chuàng)面的正常愈合[13-14]。因此，巨噬細(xì)胞和相關(guān)的炎癥因子是維護(hù)傷口愈合的重要防線，在影響潰瘍愈合中的地位尤為重要。

免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，炎癥期糖尿病潰瘍模型組M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯減少，而M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)無(wú)明顯差別，提示糖尿病性潰瘍?cè)缙贛1型巨噬細(xì)胞數(shù)量不足，可能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的正常功能無(wú)法正常發(fā)揮，進(jìn)而影響創(chuàng)面愈合。而增殖期各組M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量區(qū)別不明顯。但糖尿病性模型組M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯較少，提示在創(chuàng)面轉(zhuǎn)歸階段，糖尿病性潰瘍創(chuàng)面M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量分泌不足，可能引起炎癥反應(yīng)不正常的強(qiáng)化和遷延，對(duì)周圍組織和細(xì)胞造成損傷，同時(shí)影響M2型巨噬細(xì)胞增加VEGF表達(dá)和促重塑作用的正常發(fā)揮，從而影響創(chuàng)面愈合。

通過(guò)糖尿病潰瘍模型組和正常組創(chuàng)面炎癥因子前后動(dòng)態(tài)變化的比較發(fā)現(xiàn)，正常創(chuàng)面增殖期的IL-1、IL-6、TNF-α與早期相比明顯下降，IL-10明顯上升，提示促炎因子數(shù)量的遞減和抑炎因子的遞增是炎癥向修復(fù)過(guò)渡的正常過(guò)程。而糖尿病潰瘍模型組創(chuàng)面IL-1β、TNF-α和IL-6在炎癥期表達(dá)水平低下，無(wú)法如正常創(chuàng)面一樣產(chǎn)生適度的炎癥反應(yīng)，不能快速清除阻礙創(chuàng)面生長(zhǎng)的病原微生物和壞死組織，從而延遲了創(chuàng)面愈合進(jìn)程，且在增殖期促炎因子反而較前明顯升高，同時(shí)抑炎因子上升遲緩，故而不僅直接影響到早期炎癥反應(yīng)的程度，又使后期病態(tài)的炎癥反應(yīng)遷延不愈。因此，從動(dòng)態(tài)觀察角度可以發(fā)現(xiàn)，隨著創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程由炎癥期向增殖修復(fù)過(guò)程轉(zhuǎn)變，促炎因子的轉(zhuǎn)化和抑炎因子的調(diào)控可能是促使炎癥期順利過(guò)渡的關(guān)鍵因素，而糖尿病導(dǎo)致的慢性創(chuàng)面常常存在炎癥因子轉(zhuǎn)化過(guò)渡方面的功能障礙，可能是糖尿病性創(chuàng)面延遲愈合的重要因素之一。

綜上所述，糖尿病性潰瘍延遲愈合的原因可能與巨噬細(xì)胞表型和轉(zhuǎn)化異常，以及炎癥因子間的動(dòng)態(tài)失衡有關(guān)。本研究分析結(jié)果可能為糖尿病皮膚潰瘍的進(jìn)一步相關(guān)研究提供了理論依據(jù)和作用靶點(diǎn)。