楊曉妍 張樂(lè)之 賀琤雯

1海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心，上海 200433；2海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科，上海 200433

IgG4相關(guān)性疾病(immunoglobulin G4-related disease，IgG4-RD)是一種原因不明的慢性自身免疫介導(dǎo)的炎癥性、纖維化性疾病，可累及全身多個(gè)器官和系統(tǒng)。2001年Hamano等[1]首次報(bào)道硬化性胰腺炎患者血清IgG4濃度升高。孫林等[2]報(bào)道血清IgG4對(duì)自身免疫性胰腺炎(autoimmune pancreatitis，AIP)與慢性胰腺炎、胰腺癌的鑒別診斷具有重要價(jià)值。近年來(lái)IgG4作為AIP早期診斷、療效檢測(cè)和預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的指標(biāo)，在AIP診治方面起到了重要的作用[3]。目前定量檢測(cè)IgG4的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法[4]、免疫散射比濁法[5]。酶聯(lián)免疫吸附法靈敏、特異，但需多次洗滌和孵育，操作繁瑣，且定量測(cè)定結(jié)果不穩(wěn)定。免疫散射比濁法具有精確、簡(jiǎn)便、可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但脂血或溶血樣本會(huì)干擾IgG亞類的檢測(cè)，且成本較高。本研究建立了一種適用于即時(shí)檢驗(yàn)(point of care testing，POCT)的熒光標(biāo)記技術(shù)與免疫層析技術(shù)相結(jié)合的快速定量檢測(cè)方法，適用于門(mén)急診批量樣本的定量檢測(cè)。

材料與方法

一、材料

收集海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科經(jīng)全自動(dòng)蛋白分析儀BNⅡ系統(tǒng)測(cè)定過(guò)IgG4濃度的383例臨床血清樣本，其中胰腺炎相關(guān)疾病115例，其他疾病268例。杭州康知生物科技有限公司提供的200例健康人(年齡均>18歲，男女比例各50%)血清樣本IgG濃度作為正常參考值。

鼠抗IgG4單克隆抗體、IgG4參考品及熒光微球由杭州康知生物科技有限公司提供。干式熒光免疫分析儀由蘇州和邁精密儀器有限公司生產(chǎn)。硝酸纖維素膜(NC膜)購(gòu)自德國(guó)Sartorius Stedim公司。全自動(dòng)蛋白分析儀BNⅡ系統(tǒng)和IgG4測(cè)定試劑盒(免疫散射比濁法)購(gòu)自西門(mén)子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品(上海)有限公司。

二、方法

1．熒光免疫層析法檢測(cè)IgG4的原理：將免疫層析法與熒光定量技術(shù)相結(jié)合，采用競(jìng)爭(zhēng)法反應(yīng)模式，以鼠抗人IgG4單克隆抗體標(biāo)記在時(shí)間分辨熒光微球上作為檢測(cè)抗體，NC膜的檢測(cè)線(T線)包被大腸桿菌表達(dá)的IgG4抗原，質(zhì)控線(C線)包被羊抗鼠IgG，將樣本與熒光微球均勻混合，通過(guò)層析方法檢測(cè)。若樣本中含有IgG4，首先與熒光微球上標(biāo)記的IgG4抗體相結(jié)合，再與C線上的羊抗鼠IgG形成免疫復(fù)合物；若樣本中不含IgG4，則熒光微球上標(biāo)記的IgG4抗體與T線上的IgG4抗原形成免疫復(fù)合物。T線和C線上的熒光信號(hào)比值(T/C值)與待測(cè)樣本的IgG4含量呈反比。根據(jù)IgG4標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣本的IgG4含量。

2．熒光免疫層析試劑盒的制備：(1)檢測(cè)卡制備。用包被緩沖液分別將IgG4抗原和羊抗鼠IgG抗體稀釋至0.2 mg/ml，噴涂到NC膜上相對(duì)應(yīng)的T線和C線，45℃過(guò)夜烘干。底板上依次粘貼樣品墊、NC膜和吸水紙，組裝成檢測(cè)卡(圖1)，4～30℃保存?zhèn)溆谩?2)鼠抗人IgG4單抗標(biāo)記的熒光微球制備。將熒光微球溶解于硼酸緩沖液，加入適量碳化二亞胺(1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亞胺，EDC)，室溫活化15 min，加鼠抗人IgG4單抗，室溫震蕩標(biāo)記2 h，然后加入封閉液封閉1 h后離心，按(100～200)∶1比例用硼酸緩沖液重懸鼠抗人IgG4單抗標(biāo)記的熒光微球，置2～8℃保存?zhèn)溆谩?3)IgG4標(biāo)準(zhǔn)曲線ID卡。測(cè)試9.87、5.20、2.72、1.20、0 g/L IgG4標(biāo)準(zhǔn)品的熒光信號(hào)均值，輸入干式熒光免疫分析儀軟件，四參數(shù)logistic擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，制備ID卡。

圖1 檢測(cè)卡組成

3．熒光免疫層析法的性能評(píng)價(jià)：(1)線性范圍。參考《體外診斷試劑分析性能評(píng)估系列指導(dǎo)原則》，取高濃度樣本(接近10 g/L)、低濃度樣本(樣本稀釋液)各一份，依次按照10/10、8/10、4/10、2/10、1/10、1/20、1/50稀釋，重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算每點(diǎn)均值作為Y軸，以理論濃度值為X軸，做散點(diǎn)圖并進(jìn)行直線回歸分析。(2)精密度與準(zhǔn)確度。分別對(duì)濃度為1.20 g/L和2.65 g/L的IgG4標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度測(cè)試10次，取均值，計(jì)算各濃度變異系數(shù)(coefficient of variation, CV)和準(zhǔn)確度偏差。(3)干擾試驗(yàn)。選擇臨界值附近的血清樣本，分別配制含0、0.5、1.25、2.5、3、5 g/L的膽紅素樣本，含0、2、5、10、30、35 g/L的三酰甘油樣本，含0、2、5、10、12、15 g/L的血紅蛋白樣本，每個(gè)濃度樣本測(cè)試3次，取均值，計(jì)算均值與0濃度組的偏差，偏差在±15%范圍內(nèi)為本產(chǎn)品可接受的干擾物濃度。(4)穩(wěn)定性試驗(yàn)。將成品置于2～8℃冷庫(kù)保存，分別于第1、3、6、9、11、12、13、14個(gè)月測(cè)試濃度為1.20 g/L和2.65 g/L的IgG4標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度測(cè)試3次，取均值，計(jì)算均值與理論濃度的偏差，偏差在±15%以內(nèi)為試劑穩(wěn)定性良好。(5)正常參考值試驗(yàn)。應(yīng)用熒光免疫層析試劑盒檢測(cè)200例健康人血清樣本的IgG4濃度，確定IgG值的正常參考范圍。(6)臨床應(yīng)用驗(yàn)證。應(yīng)用熒光免疫層析試劑盒檢測(cè)383例臨床血清樣本的IgG4濃度，并與西門(mén)子IgG4測(cè)定試劑盒(免疫散射比濁法)檢測(cè)值比較，評(píng)價(jià)兩種方法的一致性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、熒光免疫層析法定量檢測(cè)IgG4的線性范圍和標(biāo)準(zhǔn)曲線

分析結(jié)果顯示，理論值與實(shí)測(cè)值相關(guān)性良好，在樣本濃度(0.2～10)g/L范圍內(nèi)，回歸方程為Y=1.0841X-0.379，相關(guān)系數(shù)R2=0.9970，結(jié)果呈線性(圖2)。熒光免疫層析法定量檢測(cè)IgG4的熒光信號(hào)T/C值與IgG4參考品濃度呈平滑遞減曲線(圖3)，回歸方程為Y=(0.96339+0.02874)/[1+(X/1.97249)0.99397]-0.02874，R2=0.99935，擬合度較高。

圖2 不同濃度IgG4實(shí)測(cè)值與理論值回歸圖

圖3 熒光免疫層析法測(cè)定IgG4的標(biāo)準(zhǔn)曲線

二、熒光免疫層析法定量檢測(cè)IgG4的精密度與準(zhǔn)確度

對(duì)濃度為1.20 g/L IgG4的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果為(1.31±0.09)g/L，CV為7.2%，準(zhǔn)確度偏差為8.8%；對(duì)濃度為2.65 g/L IgG4標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果為(2.84±0.16)g/L，CV為5.6%，準(zhǔn)確度偏差為7.2%。各檢測(cè)濃度的CV均<15%，準(zhǔn)確度偏差均在±15%以內(nèi)，熒光免疫層析法精密度和準(zhǔn)確度高，臨床可接受。

三、熒光免疫層析法定量檢測(cè)IgG4的抗干擾能力

不同濃度干擾樣本與0濃度組檢測(cè)偏差見(jiàn)表1，當(dāng)樣本中的血紅蛋白、三酰甘油、膽紅素的濃度分別為10、10、2.5 g/L時(shí)，測(cè)試結(jié)果偏差均在±15%以內(nèi)，不會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生明顯干擾，說(shuō)明熒光免疫層析法抗干擾能力強(qiáng)。

表1 熒光免疫層析法定量檢測(cè)IgG4的抗干擾性

四、熒光免疫層析法定量檢測(cè)IgG4的穩(wěn)定性

14個(gè)月內(nèi)檢測(cè)濃度為1.20、2.65 g/L的IgG4標(biāo)準(zhǔn)品，各濃度偏差均在±15%以內(nèi)(表2)，表明熒光免疫層析法定量檢測(cè)IgG4較穩(wěn)定，故試劑盒有效期定為12個(gè)月。

表2 熒光免疫層析法定量檢測(cè)IgG4的穩(wěn)定性

五、熒光免疫層析法定量檢測(cè)IgG4的正常參考值

表3 200例健康人血清IgG4濃度頻數(shù)分布

六、熒光免疫層析定量檢測(cè)IgG4的臨床應(yīng)用驗(yàn)證

西門(mén)子BNⅡ系統(tǒng)IgG4測(cè)定試劑盒(散射比濁法)檢測(cè)結(jié)果顯示，383例血清樣本中56例IgG4≤0.20 g/L，249例為0.20～2.03 g/L，74例為2.03～10 g/L，4例>10 g/L。熒光免疫層析定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示，383例血清樣本中42例IgG4≤0.20 g/L，267例為0.20～2.03 g/L，71例為2.03～10 g/L，3例>10 g/L。兩組數(shù)據(jù)有顯著相關(guān)性(圖4)，線性回歸方差為Y=0.9924X-0.0240，R2=0.9880，P<0.05，方程斜率的95%CI為0.9814～1.0034，截距的95%CI為-0.0776～0.0297。經(jīng)秩和檢驗(yàn)，兩種檢測(cè)方法的結(jié)果偏差無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-0.7141，P=0.4752)，具有很好的一致性。

熒光免疫層析法定量檢測(cè)的IgG4值的ROC曲線分析見(jiàn)圖5，AUC值為0.992，95%CI為0.953～1.000，計(jì)算獲得的臨界值為2.01 g/L，診斷胰腺炎相關(guān)疾病的靈敏度為96.3%，特異度為95.5%。

圖4 熒光免疫層析法與免疫散射比法檢測(cè)IgG4結(jié)果的相關(guān)性

圖5 熒光免疫層析法定量檢測(cè)胰腺炎相關(guān)疾病IgG4的ROC曲線

討 論

AIP是一種自身免疫介導(dǎo)的胰腺慢性炎癥，是慢性胰腺炎的特殊類型，目前發(fā)病機(jī)制尚不清楚。作為全新的臨床疾病獨(dú)立分型，AIP正受到越來(lái)越多的關(guān)注，其早期診斷與治療、預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)與判斷預(yù)后及提高診治水平已成為目前研究的重點(diǎn)。目前AIP的診斷標(biāo)準(zhǔn)主要有日本胰腺協(xié)會(huì)(JPS)2006年修改后標(biāo)準(zhǔn)[6]、韓國(guó)2006年Kim標(biāo) 準(zhǔn)[7]、美國(guó)MayoClinic的2006年HISORt標(biāo)準(zhǔn)[8]和2008年的亞洲標(biāo)準(zhǔn)[9]，以及最近發(fā)表的IgG4相關(guān)性疾病診治中國(guó)專家共識(shí)[10]。雖然AIP診治標(biāo)準(zhǔn)不盡相同，但以上各標(biāo)準(zhǔn)中的血清學(xué)指標(biāo)均包括血清 IgG4水平升高，可見(jiàn)血清 IgG4水平升高對(duì) AIP的診斷非常重要。近年來(lái)IgG4作為AIP早期診斷、療效檢測(cè)和預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的指標(biāo)，為AIP的診治開(kāi)辟了新的途徑[11]。

本研究建立了一種快速檢測(cè)血清IgG4的方法，檢測(cè)的線性范圍為0.2～10 g/L，試劑盒在線性范圍內(nèi)對(duì)200例健康人血清IgG4水平進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)95百分位法分析，得到健康人血清IgG4的95%CI的上限為2.03 g/L。臨床驗(yàn)證結(jié)果證實(shí)，該試劑盒與西門(mén)子BNⅡ系統(tǒng)免疫球蛋白G4測(cè)定試劑盒(散射比濁法)具有良好的相關(guān)性(R2=0.9880)，兩種檢測(cè)方法結(jié)果偏差無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有一致性。通過(guò)ROC曲線分析，以2.01 g/L為臨界值，該試劑盒診斷胰腺炎相關(guān)疾病的靈敏度為96.3%，特異度為95.5%。

目前，血清IgG4含量檢測(cè)的方法主要有放射免疫擴(kuò)散法、酶聯(lián)免疫吸附法、散射比濁法。本研究采用熒光免疫層析法，是將抗體使用熒光標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，通過(guò)免疫層析的方法使標(biāo)記抗體和待測(cè)物在膜上通過(guò)毛細(xì)管作用進(jìn)行層析。 該方法是一種微量分析方法，根據(jù)熒光強(qiáng)度，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量分析，具有高靈敏度、選擇性強(qiáng)、需要樣本量少及操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)；還具有試劑以及儀器方便攜帶、試劑穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)單不需要專職人員操作、可以進(jìn)行臨床實(shí)時(shí)檢測(cè)服務(wù)的特點(diǎn)。

與現(xiàn)有同類產(chǎn)品相比，本研究所建立的的IgG4熒光免疫層析定量檢測(cè)方法為國(guó)內(nèi)首創(chuàng)，具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，不受血清血紅蛋白、三酰甘油和膽紅素等干擾物質(zhì)的影響，試劑盒12個(gè)月內(nèi)有效；檢測(cè)的靈敏度和特異度高達(dá)96.3%及95.5%，重復(fù)性和穩(wěn)定性好，與散射比濁法具有良好的相關(guān)性(R2=0.9880)；僅需20 μl抗凝血漿樣本，樣本隨到隨檢，儀器測(cè)試時(shí)間<5 s，整個(gè)檢測(cè)流程短，15 min即可出報(bào)告；有3種適用的輕便機(jī)型，設(shè)備便攜，可采用單機(jī)或PC聯(lián)機(jī)工作模式，儀器接口多樣，支持醫(yī)院LIS系統(tǒng)連接功能，操作簡(jiǎn)便；試劑盒內(nèi)配的ID卡可存儲(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定量，因此適用于各大醫(yī)院門(mén)急診檢驗(yàn)科和基層醫(yī)院等應(yīng)用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突