余 立

(麻城市人民醫(yī)院，湖北 黃岡 438399)

五倍子是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，藥用歷史悠久，其中富含鞣質(zhì)，具有多種藥理活性。鞣質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)有沉淀作用，皮膚、黏膜或潰瘍部位接觸鞣酸后，組織蛋白即被凝固，形成一層薄膜而呈收斂作用，同時(shí)組織中的血管也被迫收縮，使血液凝結(jié)而發(fā)揮止血功效，因此五倍子具有收斂、止血和抗菌等藥理作用[1]，是治療皮膚燒傷燙傷的有效藥物。由于鞣酸易水解成為沒(méi)食子酸，且沒(méi)食子酸在人體內(nèi)易被吸收和代謝[2]，因此其含量難以得到有效控制。近年來(lái)，五倍子在外用制劑中的研究日益受到重視，其中五倍子凝膠劑是由五倍子單味藥材制成的新型外用凝膠制劑，為有效控制制劑中有效成分鞣酸的含量，提高制劑質(zhì)量，本研究中采用薄層色譜法鑒別五倍子中的沒(méi)食子酸，并通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定其含量，以期為五倍子凝膠劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

日本島津LC-10AT高效液相色譜儀(LC-10ATvp溶劑輸送泵(分主/A泵和副/B泵)、Rheodyne 7725i手動(dòng)進(jìn)樣閥、SPD-10Avp紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器)；JA2003N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；CH-PJJ-1 型精密增力電動(dòng)攪拌器(常州澳華儀器有限公司)；HH-21數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司)。

沒(méi)食子酸對(duì)照品 (中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110831-201305)；五倍子(三九藥業(yè))經(jīng)武漢理工大學(xué)劉小平教授鑒定符合藥典標(biāo)準(zhǔn)[3]。甲醇為色譜純，水為重蒸水，其他所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 處方與制備

2.1.1 處方 五倍子5 g，卡波姆9 401 g，甘油10 g，羥苯乙酯1 g，乙醇、丙二醇各5%，三乙醇胺適量，重蒸水，制成凝膠劑100 g。

2.1.2 制備 將卡波姆940粉末均勻地撒于甘油表面[4]，使卡波姆充分潤(rùn)濕，之后加入60 mL 水使卡波姆充分溶脹，再加入五倍子提取液15 mL；將羥苯乙酯溶于乙醇、丙二醇后 緩慢加入到上液中；再將吐溫-80和三乙醇胺溶于10 mL水中，在攪拌條件下加入上液中，攪拌至均勻，得到淡黃色凝膠，其質(zhì)地均勻細(xì)膩，無(wú)氣泡。

2.2 定性鑒別

取本品1 g，置于10 mL量瓶中，加入50%甲醇10 mL，超聲處理5 min后，離心，取上清液作為供試品溶液[5]。同法處理空白凝膠，作為陰性對(duì)照溶液。取五倍子對(duì)照藥材0.5 g，加甲醇5 mL，超聲處理15 min，濾過(guò)，制成對(duì)照藥材溶液。再取沒(méi)食子酸對(duì)照品，加甲醇制成1.0 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法(附錄VI B)進(jìn)行試驗(yàn)[6]，吸取上述3種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸(5∶5∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)后取出并晾干，置于紫外燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜中高度相當(dāng)?shù)奈恢蒙希@現(xiàn)出相同顏色的斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

圖1 五倍子TLC鑒別

2.4 含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 固定相：ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.1%的磷酸溶液(10∶90)；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：273 nm。

2.4.2 線性關(guān)系考察 將沒(méi)食子酸對(duì)照品干燥至恒重，精密稱取12.00 mg，置25 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得0.48 mg/mL對(duì)照品溶液。分別移取對(duì)照品溶液1 mL、3 mL、5 mL、7 mL、9 mL分別置于25 mL容量瓶中，用50%甲醇將上述溶液稀釋至刻度，其濃度分別為19.2 μg/mL、57.6 μg/mL、96.0 μg/mL、134.4 μg/mL、240.0 μg/mL。分別進(jìn)樣10 μL，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定[7]，以峰面積(Y)對(duì)濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=38 389X+79 336，R2=0.999 6。結(jié)果顯示沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液在19.2～240.0 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系[8]。

2.4.3 供試品溶液制備 稱取五倍子凝膠供試品約10 g，置于100 mL燒杯中，精密加入4 mol/mL的鹽酸溶液使其溶化成水狀，將液體轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用重蒸水定容，搖勻，離心15 min，取上清液用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.4.4 空白干擾試驗(yàn) 按處方中各成分比例，制備不含五倍子的空白凝膠，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備空白溶液[9]，依法測(cè)定，結(jié)果無(wú)干擾，見(jiàn)圖2。

圖2 五倍子凝膠HPLC色譜

2.4.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μL，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積平均值為2 859 892，RSD為0.44%，表明本試驗(yàn)精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μL，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，計(jì)算供試品中沒(méi)食子酸的峰面積的RSD為3.03%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取凝膠樣品5份，每份約10 g。按上述方法制備供試品溶液，重復(fù)平行測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，五倍子凝膠中沒(méi)食子酸峰面積的RSD為1.91%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.4.8 回收率試驗(yàn) 稱取凝膠10 g，置于100 mL容量瓶中，加入定量的沒(méi)食子酸對(duì)照品，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定沒(méi)食子酸的含量，記錄色譜圖，并計(jì)算平均加樣回收率為99.53%，RSD為0.33%(n=5)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 凝膠回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4.9 樣品測(cè)定 分別按照“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下分別測(cè)定3批樣品。結(jié)果顯示，3批樣品的平均含量分別為1.31 mg/g、1.30 mg/g、1.31 mg/g。

2.5 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.5.1 離心試驗(yàn) 取3批凝膠樣品各5 g，置于離心管中，以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心30 min后，凝膠未見(jiàn)分層現(xiàn)象，且倒置均不滑落。

2.5.2 耐熱試驗(yàn) 取3批凝膠樣品各5 g，置于55 ℃恒溫水浴箱中8 h，凝膠未見(jiàn)分層現(xiàn)象。

2.5.3 耐寒試驗(yàn) 取3批凝膠樣品各5 g，-15 ℃放置24 h，未見(jiàn)分層現(xiàn)象。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)所制備凝膠為淡黃色的半固體，其質(zhì)地均勻細(xì)膩，在3 000 r/min轉(zhuǎn)速下未出現(xiàn)分層和結(jié)塊現(xiàn)象，載藥量以沒(méi)食子酸計(jì)，平均每克凝膠含1.31 mg。溫度試驗(yàn)表明本凝膠應(yīng)儲(chǔ)存于陰涼處。本實(shí)驗(yàn)中的制備工藝操作簡(jiǎn)單，制得的制劑穩(wěn)定。

本實(shí)驗(yàn)還選擇了卡波姆、海藻酸鈉、泊洛沙姆3種水溶性凝膠基質(zhì)進(jìn)行比較[10]，結(jié)果表明，使用這3種基質(zhì)制備的凝膠外觀性狀均較好，但是經(jīng)過(guò)熱恒溫、低溫和離心試驗(yàn)后，以卡波姆940作為基質(zhì)制成的五倍子凝膠劑的外觀性狀和穩(wěn)定性要高于海藻酸鈉和泊洛沙姆407作為基質(zhì)的凝膠劑。

卡波姆溶脹過(guò)程中適當(dāng)攪拌可以促進(jìn)其溶脹，采用酸堿法工藝，可隨意攪拌，不必顧忌氣泡多少，調(diào)整pH后，膠體的黏度極大降低，氣泡將會(huì)全部消失，此時(shí)可很方便簡(jiǎn)單地將有關(guān)藥物溶入其中，需要時(shí)還可濾過(guò)。進(jìn)行酸堿中和后，液體會(huì)隨即變成凝膠狀[11]，故加堿時(shí)應(yīng)引流，不能帶入氣泡，攪拌動(dòng)作要均勻，可得到不含氣泡的清晰透明的凝膠，若調(diào)整pH后進(jìn)行濾過(guò)，可使凝膠更加細(xì)膩。當(dāng)以NaOH為中和劑時(shí)，使用稀HCl調(diào)pH時(shí)應(yīng)控制其用量，越少越好，因?yàn)樯傻腘aCl會(huì)一定程度上降低凝膠黏度，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2.6% (w/v)的NaCl可使凝膠變成液體，故在本次凝膠配方中使用了有機(jī)胺三乙醇胺作為中和劑。