曾 金，李 萍，歐人豪，肖 萍

(柳州市婦幼保健院，廣西科技大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院/兒童醫(yī)院，廣西 柳州 545001)

參柏濕疹搽劑是柳州市婦幼保健院皮膚科用于治療皮膚濕疹的經(jīng)驗(yàn)方(以?xún)和颊邽橹?，由苦參、黃柏、地榆、紫草、馬齒莧、雷公藤、丹參七味中藥組成，組合新穎，療效明確可靠，具有清熱燥濕止癢、涼血活血透疹的功效[1]。本研究擬通過(guò)制定方中苦參堿和氧化苦參堿、黃柏堿和小檗堿的高效液相含量測(cè)定法，來(lái)達(dá)到控制藥物質(zhì)量的目的。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(島津香港有限公司)；電子分析天秤(型號(hào)FA1004，上海天平儀器廠(chǎng))；數(shù)顯恒溫水浴鍋(型號(hào)HH-6，江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠(chǎng))；數(shù)控超聲波清洗器(型號(hào)KQ-300DB，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑

對(duì)照品均為南京源植生物科技有限公司生產(chǎn)：黃柏堿對(duì)照品(批號(hào)yz180414)、小檗堿對(duì)照品(批號(hào)yz180103)、苦參堿對(duì)照品(批號(hào)yz170331)、氧化苦參堿對(duì)照品(批號(hào)yz170614)；參柏濕疹搽劑樣品(每瓶500ml)由柳州市婦幼保健院藥劑科制劑室提供(批號(hào)：20200423，20200522，20200624 )；乙腈(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司 20200221)、甲醇(天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司 633379)為色譜純；其他試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 苦參堿和氧化苦參堿含量測(cè)定

2.1.1 溶液的制備 ①供試品溶液：精密量取濕疹方樣品5 mL，置于分液漏斗中，加入濃氨試液1 mL，充分振搖后，靜置30 min，用30 mL氯仿分3次萃取，每次10 mL，收集氯仿層，置于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘?jiān)?.1%磷酸水溶液溶解定容至25 mL，微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。②陰性對(duì)照：按參柏濕疹搽劑處方工藝制備缺苦參的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成缺苦參的陰性對(duì)照溶液。③混合對(duì)照品溶液：精密稱(chēng)取苦參堿對(duì)照品和氧化苦參堿適量，用0.1%磷酸水超聲溶解，定容，得到70.4μg/mL苦參堿，19.2μg/mL氧化苦參堿混合對(duì)照溶液[2-7]。

2.1.2 色譜條件 Diamonsil C18(2)(250 mm×4.6 mm，5μm)，流動(dòng)相為乙腈-甲醇-0.1%磷酸=3∶4∶93，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，波長(zhǎng)220 nm，進(jìn)樣量20μL。

2.1.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 分別取混合對(duì)照品溶液，供試品溶液和陰性對(duì)照溶液20μL按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜(見(jiàn)圖1)。結(jié)果表明，供試品溶液中苦參堿和氧化苦參堿色譜峰于相鄰色譜峰有效分離，分離度均大于1.5，陰性對(duì)照表明無(wú)其他雜質(zhì)干擾。

注：A.混合對(duì)照；B.樣品；C.陰性對(duì)照。

2.1.4 線(xiàn)性關(guān)系 精密稱(chēng)取苦參堿對(duì)照品4.4 mg，氧化苦參堿對(duì)照品1.2 mg，加適量0.1%磷酸溶液超聲溶解，定容至25 mL。分別取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，用0.1%磷酸溶液定容至5 mL，得到苦參堿17.6、35.2、70.4、105.6、140.8、176μg/mL和氧化苦參堿4.8、9.6、19.2、28.8、38.4、48μg/mL的混合對(duì)照溶液。以0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾后按“2.1.2”色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，以峰面積為Y軸，對(duì)照品濃度為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到苦參堿回歸方程為y=11 608x+38 703 (R2=0.999 5)，氧化苦參堿回歸方程為y=12 758x+22 513(R2=0.999 9)，結(jié)果表明，苦參堿在17.6～176μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，氧化苦參堿在4.8～48μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.1.5 精密度 精密吸取制備好的同一供試品溶液20μL，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，苦參堿、氧化苦參堿峰面積的RSD分別為0.943%、0.465%(n=6)，表明該色譜條件下方法精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性 精密吸取制備好的同一供試品溶液20μL，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件，分別在制備樣品后 0、2、4、6、8、10、24 h 進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果顯示，苦參堿、氧化苦參堿峰面積的RSD分別為1.23%、1.52%(n=6)，均>3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性 取同一批次參柏濕疹搽劑，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6份，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，苦參堿、氧化苦參堿的平均含量分別為226.19、33.78μg/mL，RSD分別為 1.41%、1.75%(n=6)，均<3%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.1.8 加樣回收率 取已知含量的同一批次參柏濕疹搽劑2.5 mL，混合對(duì)照2.5 mL(其中苦參堿∶樣品含量=0.5∶1，氧化苦參堿∶樣品含量=1∶1)，再按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，苦參堿和氧化苦參堿的平均加樣回收率分別為 105.36%、92.37%，RSD分別為2.68%、2.89%(n=6)，表明該方法準(zhǔn)確度較好，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 苦參堿和氧化苦參堿加樣回收測(cè)定結(jié)果 (n=6)

2.1.9 樣品含量測(cè)定 取3個(gè)批次(批號(hào)20200423、20200522、20200624)參柏濕疹搽劑樣品各一瓶，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液各3份，供試品溶液及混合對(duì)照品溶液各20 μL，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品中苦參堿和氧化苦參堿的含量。結(jié)果顯示，3個(gè)批次樣品中苦參堿、氧化苦參堿的平均含量分別為208.44μg/mL、41.04μg/mL，平均總含量為249.48μg/mL。根據(jù)3批樣品含量測(cè)定結(jié)果可知，制劑中苦參堿和氧化苦參堿總量的平均值為124.72 mg/瓶，按平均含量的80%設(shè)限，初步擬定以苦參堿、氧化苦參堿總量計(jì)，每瓶制劑中不得少于99 mg。樣品中苦參堿、氧化苦參堿含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 三批樣品中苦參堿和氧化苦參堿含量測(cè)定結(jié)果 (μg/mL)

2.2 黃柏堿和小檗堿含量測(cè)定

2.2.1 溶液的制備 ①供試品溶液：取樣品2.5 mL，加1%鹽酸甲醇定容至5 mL，離心，取上清液微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。②陰性對(duì)照：按參柏濕疹搽劑處方工藝制備缺黃柏的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成缺黃柏的陰性對(duì)照溶液。③混合對(duì)照品溶液：精密稱(chēng)取黃柏堿對(duì)照品和小檗堿適量，用50%(1%鹽酸)甲醇水溶解，定容，得到15μg/mL黃柏堿，65μg/mL小檗堿混合對(duì)照溶液[8-12]。

2.2.2 色譜條件 Diamonsil C18(2)(250 mm×4.6 mm，5μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.2%磷酸(每100 mL含十二烷基磺酸鈉0.1g)(B)，梯度洗脫(見(jiàn)表3)，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，波長(zhǎng)284 nm，進(jìn)樣量20μL。

表3 梯度洗脫程序

2.2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 分別取混合對(duì)照品溶液，供試品溶液和陰性對(duì)照溶液20μL按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜(見(jiàn)圖2)。結(jié)果表明，供試品溶液中黃柏堿和小檗堿色譜峰與相鄰色譜峰有效分離，分離度均大于1.5，陰性對(duì)照表明無(wú)其他雜質(zhì)干擾。

2.2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密稱(chēng)取黃柏堿對(duì)照品2.4 mg，50%(1%鹽酸)甲醇水定容至10 mL，得0.24 mg/mL黃柏堿溶液。精密量取2.5 mL黃柏堿溶液置于10 mL容量瓶中，再加入精密稱(chēng)定的小檗堿對(duì)照品2.6 mg，用50%(1%鹽酸)甲醇水定容至刻度，搖勻。分別取0.4、0.8、1.25、2.1、2.5 mL，用50%(1%鹽酸)甲醇水溶液定容至5 mL，得到黃柏堿4.8、9.6、15、20.4、25.2、30μg/mL和小檗堿20.8、41.6、65、109.2、130μg/mL的混合對(duì)照溶液。以0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾后按2.2.2色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，以峰面積為Y軸，對(duì)照品濃度為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到黃柏堿回歸方程為y=28 545x+12 888 (R2=0.999 9)，小檗堿回歸方程為y=51.187x+98.34 (R2=0.999 5)，結(jié)果表明，黃柏堿在4.8～30μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，小檗堿在20.8～130μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

注：A.混合對(duì)照；B.樣品；C.陰性對(duì)照。

2.2.5 精密度 精密吸取制備好的同一供試品溶液20μL，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，黃柏堿、小檗堿峰面積的RSD分別為0.874%、1.643%(n=6)，表明該色譜條件下方法精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性 精密吸取制備好的同一供試品溶液20μL，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件，分別在制備樣品后 0、2、4、6、8、10、24 h 進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果顯示，黃柏堿、小檗堿峰面積的RSD分別為1.15%、1.90%(n=6)，均<3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性 取同一批次參柏濕疹搽劑，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6份，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，黃柏堿、小檗堿的平均含量分別為24.5、84.5μg/mL，RSD分別為 1.46%、2.16%(n=6)，均<3%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.2.8 加樣回收率 取已知含量的同一批次參柏濕疹搽劑1.5 mL，混合對(duì)照1.5 mL(其中黃柏堿∶樣品含量=2∶1，小檗堿∶樣品含量=2∶1)，再按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，黃柏堿和小檗堿的平均加樣回收率分別為 98.52%、95.6%，RSD分別為2.67%、2.96%(n=6)，表明該方法準(zhǔn)確度較好，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.2.9 樣品含量測(cè)定 取3個(gè)批次(批號(hào)20200423、20200522、20200624)參柏濕疹搽劑樣品各一瓶，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液各3份，供試品溶液及混合對(duì)照品溶液各20μL，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品中黃柏堿和小檗堿的含量。結(jié)果顯示，3個(gè)批次樣品中黃柏堿、小檗堿的平均含量分別為25.39μg/mL、84.99μg/mL。根據(jù)3批樣品含量測(cè)定結(jié)果可知，制劑中黃柏堿含量的平均值為12.70 mg/瓶，小檗堿含量的平均值為42.50 mg/瓶，按平均含量的80%設(shè)限，初步擬定以黃柏堿每瓶制劑中不得少于10 mg、小檗堿每瓶制劑中不得少于34 mg。樣品中黃柏堿、小檗堿含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 黃柏堿和小檗堿加樣回收測(cè)定結(jié)果 (n=6)

表5 三批樣品中黃柏堿和小檗堿含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

苦參和黃柏是參柏濕疹搽劑方中的君藥，所以選擇對(duì)苦參和黃柏進(jìn)行定量檢測(cè)，以苦參中主要有效成分苦參堿、氧化苦參堿，黃柏中的主要有效成分黃柏堿和鹽酸小檗堿為檢測(cè)指標(biāo)建立了高效液相色譜含量測(cè)定方法。因?yàn)橹兴帍?fù)方制劑中苦參堿和氧化苦參堿在一定條件下可以相互轉(zhuǎn)化，所以選擇苦參堿和氧化苦參堿的總量為檢測(cè)指標(biāo)。

苦參堿和氧化苦參堿加樣對(duì)照品的配制方法，開(kāi)始做加樣回收率不理想，排除對(duì)照品經(jīng)過(guò)樣品處理方法會(huì)發(fā)生變化的可能，考慮到配制對(duì)照品的溶劑為0.1%磷酸水，而樣品為水溶液，加入樣品后可能會(huì)對(duì)含量產(chǎn)生影響，故調(diào)整對(duì)照品的配置溶劑為蒸餾水?？紤]到制定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)所用對(duì)照品的配制溶劑為0.1%磷酸水，在測(cè)加樣回收樣品前，測(cè)試樣品含量，對(duì)照品含量，經(jīng)過(guò)調(diào)整后，加樣回收率正常。

黃柏堿和小檗堿對(duì)照品配制溶劑，檢測(cè)黃柏堿和小檗堿時(shí)樣品處理為取2.5 mL樣品，加入1%鹽酸甲醇定容至5 mL，目標(biāo)峰型較好。對(duì)照品的配制原來(lái)使用50%的甲水配制，在加樣回收時(shí)小檗堿回收率不理想。嘗試甲醇，50%甲水和1%鹽酸甲醇配制后，發(fā)現(xiàn)小檗堿的吸收峰面積會(huì)隨著配制溶劑的不同而發(fā)生較明顯的變化，故決定將對(duì)照品配制溶劑改為50%(1%鹽酸)甲醇水，與樣品處理后的溶劑一致，小檗堿的回收率也正常了。

綜上所述，本研究建立了參柏濕疹搽劑中苦參堿、氧化苦參堿和黃柏堿、小檗堿的HPLC含量測(cè)定方法，并初步擬定了苦參堿和氧化苦參堿總量計(jì)，每瓶不少于99 mg，黃柏堿、小檗堿每瓶分別不少于10 mg和34 mg的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。