余光輝,涂奕霏,李承龍,周雪妹,劉冰(中南民族大學 生命科學學院,武漢 430074)

γ-氨基丁酸(GABA)是一種代謝型信號分子，在植物發(fā)育中扮演著代謝調(diào)控和信號調(diào)控的雙重作用(圖1)[1-3]. 在農(nóng)業(yè)實踐中，外源GABA的施用能提高香米中一種芳香化合物(2-乙酰-1-吡咯啉,2AP)的含量[4]. 外源GABA可改善玉米早期生長的凈光合效率[5]. GABA可以誘導植物對丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)的抗性[6]，其可能途徑與免疫反應[7]、ROS的調(diào)節(jié)[8]有關，從而緩解植物的生物脅迫[9]. 此外，本課題組的研究也證實了GABA代謝可作為一個負反饋信號分子參與氣孔開度[10]、根毛發(fā)育[11]和葉片細胞內(nèi)復制[12]的調(diào)節(jié)過程. 最新的研究證實了GABA通過對氣孔開度的調(diào)控參與植物抗旱脅迫的水分利用效率[13].

雖然GABA在植物發(fā)育中的研究已有70多年[1]，但GABA參與信號途徑調(diào)控的許多關鍵科學問題仍懸而未決. 其中，GABA信號的產(chǎn)生、運輸和感知仍然是制約GABA在農(nóng)作物調(diào)控運用中的關鍵科學問題.

1 GABA信號的產(chǎn)生

GABA作為一種信號分子，依然有3個問題需要回答：是否存在產(chǎn)生GABA信號的信號細胞；GABA是否具有長距離運輸?shù)奶攸c；GABA信號到效應細胞后如何和受體結(jié)合發(fā)揮效應. 這些問題盡管尚無系統(tǒng)回答，但已有研究從不同側(cè)面提供了答案線索. RAMESH等概述了不同植物不同組織部位的GABA含量差異，表明了不同細胞合成GABA能力的不同[13]. 本課題組最近用GUS報告基因系統(tǒng)研究了擬南芥GABA合成的5個關鍵基因(谷氨酸脫羧酶)的時空表達分布，結(jié)果顯示GAD家族不同成員的表達模式在整個植株中呈現(xiàn)組織差異性，表現(xiàn)出區(qū)域性和局部性分布的特點(圖1).

Bar=1.0 mm圖1 GAD基因家族在擬南芥不同組織和部位的GUS表達分析Fig.1 The expression patterns of GAD promoters in different developmental stages of Arabidopsis

2 GABA信號的運輸

谷氨酸是GABA合成的前體物，通常參與受傷和蟲咬反應的遠距離信號調(diào)控，這一信號途徑由類谷氨酸受體(glutamate receptor-like,GLR) 介導[14-16]. GABA是否也參與了遠距離的信號調(diào)控目前尚缺乏清晰明確的結(jié)論. 但積累的數(shù)據(jù)似乎支持這一可能性. 主要有：GABA代謝支路可能使GABA信號限定在特定的細胞類型中，并調(diào)節(jié)細胞質(zhì)中GABA的水平[17]；胞質(zhì)中的GABA可通過質(zhì)膜上的鋁激活蘋果酸轉(zhuǎn)運蛋白(ALMT)的介導轉(zhuǎn)向質(zhì)外體中[18-19]. 但是，就GABA結(jié)合的親和性而言，ALMT轉(zhuǎn)運機制類似于質(zhì)膜上的GABA轉(zhuǎn)運蛋白(AtGAT1)[20]；質(zhì)外體中的GABA有可能是一種潛在的遠距離信號分子[2]；同位素追蹤技術發(fā)現(xiàn)了木質(zhì)部和韌皮部中有GABA放射性信號[21].

最近，本課題組用GFP熒光標記，顯示了GAD3在擬南芥根的中軸鞘的分布，顯示了GABA合成和胞外運輸?shù)南嚓P性(圖2).

Bar=250 μm圖2 GAD3在擬南芥根中柱鞘的熒光分布Fig.2 Fluorescence expression of GAD3 in pericycle of Arabidopsis roots(a) GAD3全長的熒光分布(pGAD3-GAD3:GFP);(b)GAD3核定位信號的熒光分布(pGAD3-H2B:GFP)

但是，現(xiàn)有的碎片化數(shù)據(jù)仍然不足以形成完整的GABA參與遠距離調(diào)控的動態(tài)圖景，其動態(tài)變化尚需進一步研究. 在闡明GABA信號系統(tǒng)的關鍵因素是監(jiān)測和測量外部刺激和生理反應條件下體內(nèi)GABA的實時濃度變化. 然而，GABA信號的標記一直是信號途徑研究的技術障礙. 最近，基于與GABA高親和結(jié)合位點蛋白(Atu2422)(來自熒光假單胞菌，Pseudomonasfluorescens)開發(fā)出檢測GABA的熒光傳感器(iGABASnFR)[22]，為深度解析GABA信號調(diào)控的動態(tài)網(wǎng)絡提供了研究路徑和新希望.

3 GABA受體蛋白中對GABA敏感的氨基酸結(jié)構域探索

動物的GABAA受體(GABA-AR) 是五聚體(α1β2γ2)配體門控離子通道型受體. 在受體的細胞外結(jié)構域(ECD)的β2-α1界面上有兩個GABA的結(jié)合口袋，決定了GABA羧酸鹽和氨基端的定向. 該五聚體受體中決定GABA敏感型的氨基酸殘基有環(huán)A上的Y97，環(huán)B上的Y157，環(huán)C上的F200和Y205[23]. 這些側(cè)鏈氨基酸在GABA的堿性氨基氮周圍形成一個芳香手套，F(xiàn)200和Y205的位置對陽離子-π相互作用有利. 其中Y157和Y205的替換會大大降低對GABA的敏感性. T130可能與GABA羧酸鹽形成氫鍵，而R67似乎是GABA識別的關鍵氨基酸，通過與胍基的靜電相互作用穩(wěn)定配體的羧酸鹽頭部.

研究表明，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-配體相互作用的穩(wěn)定性方面，陽離子相互作用至關重要[24]. GABAC型受體(GABA-CR)屬于Cys-環(huán)型的離子型受體. 配體結(jié)合的位點主要為多個芳香族氨基酸組成的環(huán)型結(jié)構. GABA與Tyr198之間存在強烈的陽離子-π相互作用，其中Tyr167(Y167)、Tyr200(Y200)和Tyr208(Y208)具有重要的結(jié)構互作[25].

GABAB型受體(GABA-BR)屬于G蛋白偶聯(lián)的代謝型GABA受體. 其信號的感知依靠GBR1和GBR2胞外區(qū)域形成的捕蠅草型結(jié)構域[26-28]. GABA分子結(jié)合在GBR1b-VFT的縫隙位置. 配體的羧基端與LB1的殘基Ser130(S130)和Ser153(S153)形成氫鍵，而氨基與His170(H170)和Glu349(E349)形成氫鍵，而Trp65通過范德華力接觸配體[26-27].

考慮到蛋白質(zhì)序列、結(jié)構與功能關系的非線性，一個殘基的替換，就可能導致蛋白質(zhì)功能的完全喪失或顯著降低；而序列差異很大的不同蛋白質(zhì)分子，可能具有非常類似的結(jié)構和相同的功能. 動物體系GABA 受體和信號結(jié)合位點的多變性為研究植物GABA受體提供了許多未知的不確定性.

4 潛在的植物GABA受體

植物中GABA受體研究相對缺乏，限制了GABA在植物發(fā)育調(diào)控機制的闡明及其農(nóng)業(yè)應用的前景[1,29]. 作為GABA合成的前體物，谷氨酸的信號途徑研究較為深入[15-16,30-32]. 模式植物擬南芥的研究揭示谷氨酸的信號途徑主要是通過離子型類谷氨酸受體GLR(glutamate receptor-like)來調(diào)控植物的生理過程[14-16,33]. 但是，與動物離子型谷氨基酸受體(iGluR)相比，植物中與GLR結(jié)合的配體特異性較低[31-32,34]. 暗示植物的GLR是一種比較寬泛的非特異性的氨基酸感受器，參與生物發(fā)育的多種過程[31-32].

在模式植物擬南芥中，GLR有20個成員，在發(fā)育進化上分屬于3個類別[35-37]. 通過與動物離子型谷氨酸受體(iGluR)蛋白序列的比對，發(fā)現(xiàn)在植物GLR受體蛋白的氨基酸端，有兩個結(jié)合配體的結(jié)構域，分別稱為LAOBP-Like(位于LBD區(qū)域)和LIVBP-Like(位于ATD區(qū)域)結(jié)構域. LBD區(qū)域由S1和S2兩個區(qū)段的胞外結(jié)構域組成(圖3). 其中LAOBP-Like結(jié)構域是谷氨酸及其他疏水性氨基酸結(jié)合觸發(fā)信號調(diào)控的區(qū)域，而對LIVBP-Like結(jié)構域的功能研究較少. 一個尚待證實的推論是，LIVBP-Like很可能有GABA結(jié)合的位點[38]. LAOBP-Like和LIVBP-Like結(jié)構域的功能互作及其配體調(diào)控機制尚需深入研究.

圖3 GLR家族的三個成員(GLR3.3、GLR3.4、GLR3.5)與配體結(jié)合的結(jié)構域的序列分析(MageX序列比對，SnapGene軟件構建)Fig.3 Ligand binding domain sequence analysis of three members (GLR3.3, GLR3.4 and GLR3.5) in GLR family (sequence alignment by MageX and construction by SnapGene software)

配體受體結(jié)合的計算機模擬揭示了類谷氨酸受體(GLR)胞外LAOBP-Like和LIVBP-Like結(jié)構域可能具有GABA信號分子結(jié)合的潛在靶點[39]. 其中，AtGLR家族的5個成員，AtGLR3.3 (AT1G42540)、AtGLR3.4(AT1G05200)、AtGLR3.5(AT2G32390)、AtGLR3.6(AT3G51480)和AtGLR3.7(AT2G32400)具有G蛋白偶聯(lián)的GABA受體活性[40]. 這些數(shù)據(jù)都表明AtGLR和GABA 之間可能存在相互作用，這種功能性互作需要進一步實驗證據(jù)的支持. 有趣的是，AtGLR3.7(AT2G32400)位于胞間連絲中，推測其可能和GABA信號的遠距離運輸調(diào)控有關. 雖然前期的研究揭示了AtGLR3.7 可介導花粉管生長過程中的Ca2+變化[41]，但對GABA信號調(diào)控的直接機制有待深入研究.

總之，GABA信號在調(diào)控農(nóng)作物發(fā)育上的作用依然有待于GABA受體的闡明. GLR是否兼具GABA受體的特性，需要從GLR胞外結(jié)構域與GABA結(jié)合的動力學特性以及GABA的熒光追蹤等方面進行深入研究. 新型GABA檢測熒光探針(iGABASnFR)的開發(fā)[22]為回答這些科學問題提供了基本的方法和技術手段. GABA信號途徑中缺失鏈環(huán)的補全有望最終闡釋GABA在調(diào)控植物發(fā)育中的作用機制.