王 煒，陳 琛，葛玉彬，羅俊杰

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院 生物技術(shù)研究所，蘭州 730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院 作物研究所，蘭州 730070)

高丹草(Sorghumbicolor×S.sudanense)是一年生禾本科飼草作物，具有分蘗力及再生性強、營養(yǎng)價值高、適口性好、抗逆性強及適應性廣等優(yōu)點，在畜牧草業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的開發(fā)應用前景[1-2]。

植物多倍化在進化過程和新物種的形成中起著重要作用[3-4]。與原二倍體植物相比，多倍體一般表現(xiàn)為生物量大、抗逆性強、生長旺盛等特點，在遺傳上具有更大的可塑性及生理上具有更強的適應性，因此人工誘導進行植物多倍體材料創(chuàng)制及育種已成為重要研究方向之一[5-8]。植物多倍體可通過物理、化學誘導等方法產(chǎn)生[9]。其中物理方法主要是采用輻射、變溫、機械損傷等干擾使植物細胞的正常分裂受阻，導致植株的染色體加倍[10-11]；化學誘導主要采用秋水仙素、除草劑類、異生長素類等化學誘變劑處理種子、實生苗生長點、腋芽等，抑制紡錘絲的合成使有絲分裂中斷，阻止染色體向兩極移動，從而形成兩套染色體[7,9]。物理誘變多倍體因其誘變效率較低、嵌合體產(chǎn)生的頻率高、且會產(chǎn)生基因突變，近年來應用逐漸減少。化學誘變尤其是采用秋水仙素誘導多倍體目前已成為最常用的方法[9]，在林果[12-14]、蔬菜[15-16]、中草藥[17-18]及部分禾本科植物[19-21]中得到廣泛應用。多倍體可通過表型測定、根尖染色體法、表皮氣孔保衛(wèi)細胞法、流式細胞儀以及分子標記等方法進行鑒定[12-15]。然而，目前國內(nèi)外高丹草多倍體誘導研究相對較少，國內(nèi)外僅有房永雨等[22]和周亞星等[23]對秋水仙素處理高丹草F1種子誘變效果和染色體加倍效應進行研究分析，而對于后續(xù)如何獲得穩(wěn)定高丹草多倍體材料鮮有報道。鑒于此，本研究采用秋水仙素對高丹草進行處理，通過根尖染色體法和表皮氣孔保衛(wèi)細胞鑒定法，結(jié)合表型觀察鑒定高丹草多倍體材料，通過逐代鑒定篩選，以期獲得高丹草新種質(zhì)，并為相關(guān)研究提供參考及基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試高丹草品種‘大卡’(‘Big Kahuna’)，為光敏型和褐色中脈型，來源于美國。

用于多倍體誘導和鑒定的設(shè)備及試劑：奧林巴斯顯微鏡BX51；秋水仙素(分子式C22H25NO6，分子量 399.44)購于Sigma公司；苯酚品紅染液、卡諾固定液、1 mol/L鹽酸、0.002 mol/L 8-羥基喹啉、1% I-KI染色液等試劑購自于蘭州艾爾維科學儀器有限公司；WYT型糖度計由成都豪創(chuàng)光電儀器有限公司生產(chǎn)；育苗基質(zhì)為魯億牌育苗基質(zhì)(有機質(zhì)35%～45%，腐殖酸15%～25%)，山東魯億育苗基質(zhì)有限公司生產(chǎn)。

1.2 方 法

1.2.1 秋水仙素母液的配制 取秋水仙素1 g，先用少許95%酒精助溶，溶于100 mL蒸餾水中，配成1%秋水仙素溶液。放入棕色玻璃瓶內(nèi)，置于4 ℃冰箱保存，用時再稀釋到所需濃度。

1.2.2 誘導方法 分別采用浸種法和滴生長點法兩種方法進行秋水仙素誘導高丹草多倍體的技術(shù)研究。浸種法：秋水仙素濃度設(shè)7個梯度，分別為0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%、0.14%，對照為蒸餾水，處理時間均為 24 h。選取顆粒飽滿的高丹草大卡種子，用2%的次氯酸鈉溶液消毒10 min，無菌水沖洗3次，每次3 min。消毒過的種子用無菌雙層濾紙吸干表面水分后，隨機取45粒，放入滅菌過的100 mL三角瓶中，加入相應濃度的秋水仙素溶液5 mL靜置24 h。處理結(jié)束后，用自來水沖洗30 min，再用蒸餾水沖洗3次，每次3 min；吸干種子表面水分后，移至消毒過的鋪有雙層濾紙、直徑為6 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，置培養(yǎng)箱內(nèi)23 ℃下暗培養(yǎng)3 d，轉(zhuǎn)入25 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光強度45 μmol/m2、光周期14 h。每天在培養(yǎng)皿加入1～2 mL蒸餾水。7 d后統(tǒng)計每個處理組合下的發(fā)芽數(shù)，計算發(fā)芽率。將幼苗移栽入花盆，繼續(xù)培養(yǎng)20 d后，統(tǒng)計每個處理組合下誘變苗存活數(shù)，計算致死率，并將幼苗移栽入溫室。

發(fā)芽率=發(fā)芽種子數(shù)/處理種子總數(shù)×100%

移栽成活率=誘變苗存活數(shù)/移栽時的幼苗數(shù)×100%

致死率=(1-誘變苗移栽成活率/對照移栽成活率)×100%

滴生長點法：秋水仙素濃度設(shè)為6個梯度，分別為0.01%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%，對照為蒸餾水。在花盆中點播高丹草種子，每濃度點播10盆，每盆15粒種子。待苗高 1 cm左右時，每個花盆留選長勢大小大體一致的幼苗10株，在每個幼苗的生長點部位放置大小相同的脫脂棉球，早晚各滴相應濃度的秋水仙素溶液20 μL，連續(xù)處理7 d；15 d后統(tǒng)計幼苗成活率，并將存活幼苗移栽入溫室花盆中。

1.2.3 高丹草多倍體材料的誘導 以致死量達到50%左右作為適宜的秋水仙素誘導高丹草多倍體處理24 h的濃度。2015年3月下旬，將 5 000粒高丹草種子分為兩部分：其中2 500粒用浸種法，秋水仙素處理種子后播種于育苗穴盤中。每穴點播誘變處理后的高丹草種子2粒，澆足水后置于溫室中(溫度15 ℃～28 ℃)，自然光照射，每天適量噴灑澆水。另外2 500粒先期播種后用滴生長點法處理，方法同上。

1.2.4 誘變后代材料的種植及高丹草多倍體的逐代鑒定篩選 誘變后成活的M1代高丹草材料移栽于甘肅省農(nóng)業(yè)科學院蘭州基地大田，大田覆膜，行長6.4 m，株距0.4 m，每12行設(shè)一對照(2行)，按常規(guī)育種方式管理。開花前套袋自交，成熟后全部按單株收獲。M2～M5代按株行育苗移栽，大田覆膜，常規(guī)育種方式管理，生育期內(nèi)表型觀察鑒定，選擇葉片、莖粗、分蘗、生物量等較野生型對照‘大卡’顯著增加的，采用表皮氣孔保衛(wèi)細胞大小鑒定法進行多倍體鑒定，選擇經(jīng)鑒定為多倍體的材料套袋自交，成熟后按單株收獲；待誘變后代表型性狀穩(wěn)定后，采用表型鑒定、表皮氣孔保衛(wèi)細胞大小鑒定法及根尖染色體法鑒定多倍體。

表型鑒定：移栽后參照何振富等[24]的方法觀察統(tǒng)計出苗率、中脈顏色、葉片大小、穗型等表型性狀，測定株高、單株鮮質(zhì)量等；采用游標卡尺測定莖粗；采用WYT糖度計測定含糖量。

染色體倍性鑒定：①根尖染色體鑒定法：將待鑒定的高丹草種子置于鋪有2層無菌濾紙、直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿內(nèi)加適量蒸餾水使濾紙濕潤；常溫發(fā)芽，待根長1.0～1.5 cm時，于 9:00-10:00剪下根尖；浸入0.002 mol/L 8-羥基喹啉，處理時間為2 h；取出根尖，沖洗干凈后放入卡諾固定液12 h；轉(zhuǎn)入70%乙醇中，放入4 ℃冰箱保存；將固定好的根尖放入1 mol/L鹽酸中60 ℃水浴解離10 min；將解離完成的根尖用蒸餾水沖洗干凈后，置于載玻片上，滴一滴苯酚品紅染液使根尖被完全浸潤，靜置10 min；蓋上蓋玻片，用濾紙吸去多余染液，用玻璃棒輕輕敲擊蓋玻片，使根尖細胞均勻散開；顯微鏡下觀察。原野生型對照‘大卡’為二倍體(2n=2x=20)，因此染色體為40條的為多倍體(四倍體，2n=4x=40)。②表皮氣孔保衛(wèi)細胞大小鑒定法：于9:00-10:00選取同一生長時期的植株自上而下第5片葉，在葉片中部剪大約0.5 cm2大小部分，用刀片輕輕刮去葉片上表皮及葉肉細胞，將下表皮沖洗干凈，置于載玻片上，滴加I-KI染色液使葉片表皮完全浸于染液中，染色2 min，蓋上蓋玻片后置于顯微鏡下觀察。每張片子隨機選取10個保衛(wèi)細胞，測量保衛(wèi)細胞長度并統(tǒng)計。氣孔的長寬、保衛(wèi)細胞長寬等較野生型對照‘大卡’顯著增加的認為是多倍體[25-27]。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素濃度對高丹草種子發(fā)芽和幼苗生長的影響

采用浸種法時，在處理時間均為24 h時，不同濃度秋水仙素對高丹草種子發(fā)芽率、移栽成活率有顯著影響，隨秋水仙素濃度提高，發(fā)芽率和致死率升高(表1)，表現(xiàn)出較強的濃度依賴性；當濃度達到0.10%以上時，移栽成活率均為0。以移栽成活率計算，濃度0.06%時致死率為48.80%，接近半致死劑量，因此以0.06%處理24 h作為浸種法時的秋水仙素誘導高丹草多倍體的處理 參數(shù)。

表1 不同濃度秋水仙素浸種處理24 h高丹草種子發(fā)芽及移栽成活率

由表2可以看出，利用滴生長點法時，隨著秋水仙素濃度增高，存活幼苗數(shù)逐步降低，當秋水仙素溶液濃度達到0.10%時，所有被處理后的種子無一發(fā)芽，致死率為100%；在秋水仙素濃度為 0.02%時，超過一半的種子不能發(fā)芽，致死率為52%，接近于半致死量，因此以0.02%作為滴生長點法時誘導高丹草多倍體的秋水仙素處理 濃度。

表2 不同濃度秋水仙素處理高丹草幼苗生長點7 d 幼苗存活率和致死率

2.2 秋水仙素處理高丹草誘變M1～M2情況

采用浸種法處理共出苗1 211株，移栽至覆膜大田后成活962株；采用滴生長點法處理后幼苗存活 1 107株，移栽至覆膜大田后成活803株。因此總計獲得秋水仙素M1代誘變植株1 765株，由于存在大量畸形苗以及生育期明顯延長的誘變株共812株未能獲得種子，10月下旬收獲時僅結(jié)實953株。

M2代時將953株育苗后按株行全部移栽于覆膜大田。隨機選取117份材料的株高、生育期、莖粗、葉長、含糖量、鮮質(zhì)量等6個指標進行測定(表3)。結(jié)果表明，所測定材料的平均值均低于對照材料，尤其是生育期較對照平均提前24 d，株高較對照平均降低51 cm，這可能與M1代一部分晚熟材料未能結(jié)實而自然淘汰，同時大部分株高較高的材料也晚熟等因素相關(guān)。生育期內(nèi)根據(jù)表型觀察鑒定，39株在葉片、莖粗、分蘗、生物量等較野生型對照‘大卡’顯著增加，對這些材料采用表皮氣孔保衛(wèi)細胞大小鑒定法進行多倍體鑒定，結(jié)果27株為多倍體，套袋自交后收獲結(jié)實單株12株。

表3 高丹草M2代誘變材料部分性狀鑒定

2.3 高丹草多倍體的獲得

M3～M5代按M2代的方法繼續(xù)進行高丹草多倍體鑒定，其中M3代獲得經(jīng)鑒定為多倍體單株2份，分別為DB1和DB2，M4～M5代按株行種植時表型穩(wěn)定，其生育期、株高、莖粗、葉面積和鮮質(zhì)量等指標均較對照有顯著提高(表4)；作為品質(zhì)指標之一的含糖量與對照相比無顯著性差異。

表4 高丹草多倍體材料DB1和DB2在M5代時的性狀鑒定

每份隨機選取10株分別采用表皮氣孔保衛(wèi)細胞大小鑒定法和根尖染色法進行了鑒定。結(jié)果表明，DB1和DB2的氣孔長度、氣孔寬度、保衛(wèi)細胞長度和保衛(wèi)細胞寬度均顯著高于對照(表5)；根尖染色的結(jié)果說明(圖1)，原野生型對照對照大卡的染色體數(shù)目為20條，為二倍體(2n=2x=20)，DB1和DB2則為40條，為四倍體(2n= 4x=40)。

表5 高丹草多倍體的表皮氣孔保衛(wèi)細胞法鑒定

因此，通過表型性狀、表皮氣孔保衛(wèi)細胞大小及根尖染色體鑒定相互印證，可以確定DB1和DB2為多倍體。

3 討論與結(jié)論

3.1 高丹草多倍體的誘導

近年來，因全國種植業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整及農(nóng)業(yè)供給側(cè)改革的推進[28]，草食畜牧業(yè)得到空前的重視和發(fā)展，其中優(yōu)良飼草種質(zhì)資源創(chuàng)制及品種培育是重要的基礎(chǔ)性工作。高丹草作為一種新型的優(yōu)質(zhì)牧草，其生物量的遺傳改良尤為重要。由于多倍體通常具有巨大型器官、株高增加、莖桿粗壯、生物量大、抗逆性強等優(yōu)點，因而人工誘導多倍體已經(jīng)被用于大量作物育種中，其中以秋水仙素作為誘導劑最為常見[29-32]。本研究采用浸種法中對高丹草處理24 h時的秋水仙素半致死濃度為 0.06%(表1)。房永雨等[22]采用浸種法對兩份高丹草材料進行多倍體誘導的研究表明，適宜的處理濃度和時間組合分別為0.10%/24 h和 0.05%/36 h。結(jié)果有所不同的原因可能與供試材料不同相關(guān)。對于不同植物，甚至同一植物的不同品種，最適宜的處理方式和最適宜的濃度時間組合參數(shù)不盡相同[33-36]。但已有的研究表明，秋水仙素的處理濃度及時間在某一區(qū)間內(nèi)可以有效誘導多倍體的產(chǎn)生，濃度的進一步提高和處理時間的延長會導致植株畸形苗和嵌合體增加、致死率顯著上升，多倍體誘導率反而可能下降[36-38]。本研究中滴生長點法中秋水仙素半致死濃度為0.02%(表2)，與浸種法相比濃度差距較大的原因有兩點：其一是浸種法中因種皮的阻隔使得秋水仙素直接作用于種子內(nèi)部成分的力度減弱且時間延緩，而滴生長點法則是秋水仙素直接作用于生長點；其二是浸種法中秋水仙素處理時間為 24 h，而滴生長點法則每天早晚各一次，連續(xù)處理 7 d，顯然作用時間更長，因此較低的濃度即可使致死率達到與浸種法相同的結(jié)果。本研究采用常見的毒理學研究中的半致死濃度[25]作為誘導高丹草多倍體的處理參數(shù)，用浸種法和滴生長點法分別處理了 2 500粒高丹草大卡種子和2 500粒種子所產(chǎn)生的幼苗，通過逐代鑒定篩選，至M5代時獲得了兩份高丹草多倍體材料DB1和DB2，其株高、葉面積、莖粗和生物量等于對照相比有顯著提高，而反映其品質(zhì)的指標之一含糖量與對照相比無顯著性差異(表4)。可見，這兩份多倍體材料可能具有較好的開發(fā)利用前景，除了可直接作為種質(zhì)資源使用外，經(jīng)進一步培育有望作為品種推廣應用。由于在逐代鑒定篩選過程中，一部分誘變株因畸形、生育期延后而未能收獲到種子；另外一部分則因是嵌合體，其多倍體性狀不能穩(wěn)定遺傳而被淘汰；因此，最終實際多倍體誘導率僅為2/5 000=0.04%。

3.2 高丹草多倍體的鑒定

多倍體鑒定通常先通過表型測定，再結(jié)合根尖染色體法、表皮氣孔保衛(wèi)細胞法、流式細胞儀以及分子標記等方法進行鑒定[4,37-40]。流式細胞儀和分子標記鑒定為高通量的多倍體鑒定方法，然而前者對于實驗設(shè)備的要求較高，而高丹草多倍體分子標記尚未開發(fā)出來。在M1～M3代時，由于存在嵌合體等原因誘變植株正在分離，遺傳性狀尚未穩(wěn)定，因此采用根尖染色體法鑒定多倍體有諸多不便。故而，本研究對于M1～M3代時株高、葉片大小、莖粗等較原野生型對照‘大卡’有顯著提高的誘變株，采用表皮氣孔保衛(wèi)細胞法進一步進行多倍體鑒定；鑒定后為多倍體的植株下一代按單株種植繼續(xù)鑒定篩選，至性狀穩(wěn)定的 M4～M5代時，采用表型測定、表皮氣孔保衛(wèi)細胞法和根尖染色體法三者相結(jié)合的方式進行了多倍體鑒定。從以創(chuàng)制高丹草多倍體種質(zhì)材料的目的來看，這種方式能夠有效減輕工作量，提高效率。