趙 立，魏 丹，賀瀟宇，蔣靜怡，龐文生，胡 娟,2*

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福州350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福州350122)

太子參為石竹科植物孩兒參 （Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax ex Pax et Hoffm.）的塊根，富含多糖、氨基酸、環(huán)肽、脂肪酸等營養(yǎng)成分，具有益氣健脾生津潤肺的功效[1]。 福建省寧德市柘榮縣為太子參主產(chǎn)區(qū)，是太子參單品種區(qū)劃的“最佳生產(chǎn)適宜區(qū)” 和全國太子參主要集散地之一[2]。 太子參年種植面積3 萬多畝，約占當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)收入的60%～70%，占有極其重要的地位[3]。

然而，隨著土地太子參種植年份的增長，致病菌增多，連作障礙問題加重。目前已報(bào)道的太子參病害包括葉斑病、立枯病、根腐病、紫紋羽病和白絹病等，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展， 為太子參不同的病原菌的發(fā)現(xiàn)提供了技術(shù)手段， 目前主要鑒定出的太子參病原菌有尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum、 齊整小核菌Sclerotium rolfsii 等[4,5]。 本課題組發(fā)現(xiàn)，一些地塊兒出現(xiàn)紅色的太子參，其原因不明。本研究對這種外觀呈紅色的染病太子參采樣， 并對其微生物結(jié)構(gòu)及病原菌進(jìn)行分析檢測，探究發(fā)病機(jī)制，為其科學(xué)防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Techne PCR 儀（Gene E）；Starter 3C pH 計(jì)（奧豪斯儀器（上海）有限公司）；MK2000-1 恒溫金屬?。ê贾輮W勝儀器有限公司）；5430 離心機(jī) （德國Eppendorf公司）；SW-CJ-1FD 超凈工作臺（蘇凈安泰）；Mini-4 超純水儀（英國Kertone 公司）；DW-25L262 醫(yī)用低溫保存箱（青島海爾特種電器有限公司）；BioRadModel 200/2.0 電泳儀 （美國伯樂公司）；Nanodrop2000 紫外分光光度計(jì)（美國Thermo 公司）；JS-680D 凝膠成像儀（上海培清科技有限公司）；LMQ.C 高壓滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；Qubit 熒光光度計(jì) （美國Thermo 公司）；SequelII 測序儀（美國Thermo 公司）。

1.2 病害調(diào)查與樣本的采集

2019 年期間，于福建省柘榮縣（119°51′6″ E，27°12′38″N）調(diào)查了當(dāng)?shù)刂髟云贩N太子參紅根的田間發(fā)生情況，記錄病害典型癥狀，并采集代表性樣品用于微生物多樣性分析。

1.3 基因組DNA 的提取和PCR 擴(kuò)增

采用基因組提取試劑盒對病害和正常太子參的基因組DNA 進(jìn)行提取， 之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和濃度，取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1ng/μL。 以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode 的特異引物，Toyobo 公司的KOD 酶，進(jìn)行PCR，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。

1.4 PCR 產(chǎn)物的混樣和純化

PCR 產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物， 對目的條帶使用Thermo 公司提供的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。

1.5 文庫構(gòu)建和上機(jī)測序

使用DNA 黏合酶將測序接頭連接在擴(kuò)增好的DNA 片段兩端，使用AMpure PB 磁珠對DNA 片段進(jìn)行純化選擇， 構(gòu)建SMRT Bell 文庫。 純化后的片段經(jīng)buffer 回溶后，使用BluePipin 片段篩選特定大小的片段，并AMpure PB 磁珠對DNA 片段進(jìn)行純化。 構(gòu)建好的文庫經(jīng)Qubit 濃度定量， 并利用Agilent 2100 檢測插入片段大小，隨后用PacBio 平臺進(jìn)行測序。

1.6 測序數(shù)據(jù)處理

將PacBio 下機(jī)數(shù)據(jù)導(dǎo)出bam 格式文件。使用lima軟件根據(jù)barcode 序列區(qū)分各樣本的數(shù)據(jù)， 所有樣本的序列以bam 格式保存。 然后使用CCS (SMRT Link v7.0)對序列進(jìn)行校正，矯正參數(shù)為：CCS=3，最小準(zhǔn)確率為0.99，并去除長度小于1340、最長序列長度大于1640 的序列，以fastq 和fasta 保存；隨后進(jìn)行SSR 過濾并使用cutadapt 去除掉引物， 將含有連續(xù)相同堿基數(shù)＞8 的序列過濾掉。 經(jīng)過以上處理后得到的Reads 即最終的有效數(shù)據(jù)（Clean Reads）。

利用Uparse 軟件 （Uparse v7.0.1001，http://drive5.com/uparse/） 對所有樣品的全部Clean Reads 進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性（Identity）將序列聚類成為OTUs（Operational Taxonomic Units），同時會選取OTUs的代表性序列，依據(jù)其算法原則，篩選的是OTUs 中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs 的代表序列。 對OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋， 用Mothur 方法與SILVA（http://www.arb-silva.de/）的SSUrRNA 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析（設(shè)定閾值為0.8～1），獲得分類學(xué)信息并分別在各個分類水平：kingdom （界），phylum （門），class（綱），order（目），family（科），genus（屬），species（種）統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害采樣與癥狀觀察

采集得到的患有紅根和正常太子參樣品見圖1，由圖1 可見正常的太子參呈淡黃色且表明質(zhì)地光華，而患有紅根的太子參呈紅棕色，表面粗糙，其形態(tài)明顯呈發(fā)育不良狀態(tài)。

圖1 紅根太子參發(fā)病癥狀觀察

2.2 不同太子參微生物群落分析

根據(jù)物種注釋結(jié)果， 在各分類水平上統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成，生成物種相對豐度柱狀累積圖，以便形象直觀地比較各樣本在不同分類水平上相對豐度較高的物種及比例。以門水平物種相對豐度柱形圖為例，分析紅根和正常太子參微生物群落差異，詳見圖2。

圖2 門分類水平紅根、正常太子參細(xì)菌群落組成

由圖2 可知，在細(xì)菌水平上，紅根、正常太子參細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在較大差異， 其中豐度較高的門類有變形菌門（Proteobacteria）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）。 各細(xì)菌相對含量分析顯示，紅根太子參優(yōu)勢類群為變形菌門、放線菌門和后壁菌門；而正常太子參優(yōu)勢類群為變形菌門、 藍(lán)細(xì)菌門和放線菌門。 相對正常參，紅根太子參主要增加了變形菌門、后壁菌門的相對豐度， 分別提高了46.75%和7.91%；降低藍(lán)細(xì)菌門、 放線菌門的相對豐度， 分別降低了40.05%和13.23%。

2.3 不同太子參微生物種群分析

對紅根和正常的細(xì)菌群落進(jìn)行進(jìn)一步富集， 之后進(jìn)行高通量測序建庫， 使用長讀長Pacbio 測序技術(shù)，對其所含的細(xì)菌進(jìn)行長讀長測序，并通過數(shù)據(jù)分析，得知細(xì)菌群落中含有哪些細(xì)菌，及豐度含量。由于使用了長讀長測序技術(shù)，細(xì)菌可以鑒定到“種”（species）級別。通過太子參根部微生物測序后的物種分析， 主要鑒定得到的細(xì)菌微生物種類有90 余種，幾種代表性菌株鑒定檢測結(jié)果見圖3。 其中，在發(fā)病太子參中所檢測得到的Paraburkholderia_phenazinium 菌含量極高，達(dá)到了10.71%； 而正常太子參中該菌種含量極低， 僅占0.38%，發(fā)病太子參該菌含量是正常參的28.18 倍。 因此，初步推斷該菌與太子參發(fā)育不良存在相關(guān)性。

圖3 種分類水平紅根、正常太子參細(xì)菌群落組成

3 結(jié)論與討論

根部發(fā)紅是太子參連作過程中主要的發(fā)病癥狀之一， 而微生物群落的改變及致病菌的滋生是植物發(fā)病的重要因素。因此，對于該發(fā)病植物的微生物物種及病菌分析十分重要。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用16S RNA 技術(shù)對太子參發(fā)病根部的微生物群落進(jìn)行分析，從門類分析上看，太子參感染紅根后根部變形菌、厚壁菌相對豐度增加，而藍(lán)細(xì)菌、放線菌相對豐度降低。 藍(lán)細(xì)菌可以為植物提供十分重要的有機(jī)碳源，是植物生長過程中極為重要的初級生產(chǎn)力[6]；放線菌門中包含許多可產(chǎn)抗生素、酶和有機(jī)酸等有益于植物生長的細(xì)菌[7]；變形菌門在所有細(xì)菌菌門中最為普遍，同時也包含大量動植物病原菌，其相對含量增加可能引起植物抵抗力降低，植株發(fā)病率增加[8]。 因此，這些菌群分布的失衡， 是造成太子參植物發(fā)病的重要因素。

為了進(jìn)一步分析太子參根部的致病性菌株， 本實(shí)驗(yàn)對于根部中所含的菌種進(jìn)行了鑒定。 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)病變后的太子參含有大量的Paraburkholderia_phenazinium 菌， 而正常的太子參該菌的含量極少，發(fā)病太子參該菌含量是正常參的28.18 倍。

Paraburkholderia_phenazinium 為變形菌門，β-變形菌綱，伯克氏菌目，伯克氏菌科，伯克霍爾德菌屬下的菌株[9]。 伯克霍爾德菌在植物及土壤中分布廣泛，目前該菌屬共有122 個種[10]。 目前大多數(shù)對于該菌的報(bào)道屬于對植物有益的微生物，如可以通過固氮、溶磷和分泌植物激素等作用促進(jìn)植物生長， 還可產(chǎn)生硝吡咯菌素、 吩嗪、cepaciamide A、 cepabactin、cepacidine A等多種抑菌產(chǎn)物[11,12]。

由于大部分伯克霍爾德菌表現(xiàn)出對植物有益的特性，因此20 世紀(jì)90 年代，美國環(huán)境保護(hù)署對含有伯克霍爾德氏菌菌株的幾種生防劑進(jìn)行了注冊。 在過去的幾年里，伯克霍爾德氏菌的新物種的數(shù)量大幅增加。但經(jīng)過風(fēng)險(xiǎn)評估后，這些產(chǎn)品從市場上撤出，并暫停了含有伯克霍爾德氏菌的產(chǎn)品的注冊。

隨著其新物種的數(shù)量不斷增加， 一些伯克霍爾德氏菌具有有害的屬性。例如，在水稻中發(fā)現(xiàn)的伯克霍爾德菌Burkholderia plantarii、 Burkholderia gladioli 等是引起水稻秧苗細(xì)菌性立枯病的重要病原菌之一， 其侵染性、繁殖力及適應(yīng)性均很強(qiáng)，嚴(yán)重威脅水稻生產(chǎn)[13]。因此， 目前區(qū)分伯克霍爾德菌屬下各菌株的有益及有害屬性仍是急需解決的科學(xué)問題。

從發(fā)病太子參中檢測出含有大量的Paraburkholderia_phenazinium 菌。 Paraburkholderia_phenazinium菌是一種能夠產(chǎn)酚秦碘色素的菌株，在酸性pH 值下，吩嗪色素可以被還原成紅色， 可能是太子參發(fā)病根部顏色改變的原因[14]。 吩嗪色素雖然也具有抑菌的活性，但同時具有細(xì)胞毒性，會影響根部的正常生理，導(dǎo)致植株發(fā)育不良， 這可能是引發(fā)太子參根部發(fā)育不良的重要因素[15]。 此外，該菌株在酸性土壤中具有競爭性優(yōu)勢， 這也與課題組前期所測得太子參土壤呈弱酸性的結(jié)果較為一致[16]。 基于以上幾點(diǎn)分析，推斷Paraburkholderia_phenazinium 菌與太子參發(fā)病存在相關(guān)性。

本研究首次對一種染病呈紅色的太子參微生物群落進(jìn)行了分析， 并對其發(fā)病原因進(jìn)行了探討， 通過分析，初步確定了Paraburkholderia_phenazinium 菌可能是造成太子參發(fā)育不良的原因， 但目前關(guān)于伯克霍爾德菌的好處及危害仍處于爭論之中， 且對于該病害的田間傳播規(guī)律及發(fā)病機(jī)制尚沒有報(bào)道。因此，仍需要加強(qiáng)田間病害監(jiān)測，了解其發(fā)病規(guī)律，此外，對于該植物的發(fā)病機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究， 從而制定對應(yīng)的防控策略。