劉曉峰，查道喜，朱啟法，徐方正，陳 洋，張廣雨，王學瑛，薛 琳，許立峰，張忠鋒，徐海清，張洪博

（1中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，山東青島 266101；2安徽皖南煙葉有限責任公司，安徽宣城 242099）

0 引言

太子參(Pseudostellaria heterophylla)又名童參，屬石竹科多年生草本植物，是一種珍貴的中藥材，具有悠久的藥用歷史[1]。在中醫(yī)藥應(yīng)用中，太子參可用作人參或西洋參的替代品，具有極大的藥用價值和經(jīng)濟效益，也是重要的鄉(xiāng)村振興經(jīng)濟作物[1]。太子參是一種典型的喜陰植物，自然條件下多生長于陰濕的林蔭地帶[2]。由于野生資源日趨匱乏，無法滿足市場需求，人工栽培已成為太子參的主要生產(chǎn)方法[3]。

中藥材質(zhì)量優(yōu)劣不僅與遺傳因素有關(guān)，也受到環(huán)境因素的影響[4]。人工栽培的太子參在大田種植過程中易受到自然界的強光、高溫、高濕等環(huán)境脅迫[5]。在高溫季節(jié)，太子參常會發(fā)生葉片黃化、腐爛枯苗等提前凋亡現(xiàn)象，給太子參的產(chǎn)量造成了巨大損失。探明太子參在大田種植過程發(fā)生葉片黃化及植株凋亡的生理機制可以為生產(chǎn)實踐提供理論指導。其他植物的研究表明，光照對植物的葉片黃化起著雙向調(diào)控作用[6-7]。一方面，光照能夠誘導黑暗條件下形成的植物黃化幼苗轉(zhuǎn)綠，進行正常光合作用，也是植物光形態(tài)建成的關(guān)鍵調(diào)控因子[6,8-9]；另一方面，持續(xù)光照或高強度光照會導致葉片脫綠黃化，抑制植物的正常發(fā)育[7,10]。光照誘導植物葉片變綠及光形態(tài)建成的研究相對深入，其分子調(diào)控機制也得到了揭示[6,8]。有關(guān)光照促進植物葉片黃化的研究也有不少報道[10-12]，但對其發(fā)生機制的了解還非常有限。太子參是一種喜陰的藥用作物。據(jù)報道，遮陰處理能夠在一定程度上緩解大田種植太子參的枯苗現(xiàn)象[13]，但其作用機制仍不清楚。筆者探討太子參在大田種植過程發(fā)生的葉片黃化及植株凋亡與光照強度之間的關(guān)聯(lián)，以期進一步明確光照影響太子參葉片黃化和植株凋亡的機制，為太子參的生產(chǎn)實踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試太子參是安徽省宣城市當?shù)卦耘嗥贩N。

1.2 主要儀器

實驗所用光強照度計購自深圳市華盛昌科技實業(yè)股份有限公司（可見光照度計）、北京師范大學光電儀器廠（紫外照度計和藍光輻照計），淀粉含量測定及顯微觀察所需化學試劑購自上海生工生物工程有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 太子參的田間種植與觀察 太子參的田間實驗分別在安徽省宣城市及貴州省遵義市進行。于10月中旬深翻土壤后，施足基肥，將太子參種參均勻播種后覆土5 cm，采用常規(guī)措施進行田間管理[14]。在3—7月間定期觀察太子參的葉片顏色，并取樣用于葉片的碳水化合物（可溶性糖及淀粉）含量測定以及顯微觀察。

1.3.2 太子參的溫室栽培 先按照田間種植方式，在實驗溫室培育太子參苗，后將太子參苗移植于填充了育苗基質(zhì)的育苗盤中，經(jīng)過2周的適應(yīng)性培養(yǎng)后，分別置于100、200、300 μmol/(m2·s)的光照強度（以光強照度計測定）下進行培養(yǎng)，于4周后進行葉片顏色觀察，并取樣用于葉片的碳水化合物（可溶性糖及淀粉）含量測定以及顯微觀察。

研究氮素對光照誘導太子參葉片黃化的調(diào)控作用時，利用Hoagland營養(yǎng)液、尿素和蛭石配制磷、鉀含量一致（磷0.07%，鉀0.03%），氮素含量分別為0.12%及2.4%的培養(yǎng)基質(zhì)，然后，將太子參苗分別移植于2種氮素含量的培養(yǎng)基質(zhì)中，于光照強度為200 μmol/(m2·s)的實驗溫室培養(yǎng)。4周后，分別調(diào)查不同氮素條件下的太子參苗葉片顏色，并取樣進行葉片碳水化合物（可溶性糖及淀粉）含量測定。

1.3.3 太子參葉片的可溶性糖及淀粉含量測定 準確稱取0.1 g太子參植株葉片于研缽中研碎，按照植物可溶性糖含量測定試劑盒和淀粉含量檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）說明書中的步驟，進行可溶性糖和淀粉提取、標準溶液配制、標準曲線繪制，以及樣品可溶性糖含量和淀粉含量的計算。

1.3.4 太子參葉片的透射電鏡觀察 將太子參葉片于2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液中固定4 h，以0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗3次；然后，用1%鋨酸固定液固定1.5 h，用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗3次；依次用50%丙酮、70%丙酮、90%丙酮脫水，最后用100%丙酮脫水3次；然后，使用Epon812樹脂進行樣品包埋，并依次在37、45、60℃條件下保存24 h進行固化。使用Reichert-Jung ULTRACUT E型超薄切片機將樣品切成70 nm的電鏡切片，用銅網(wǎng)撈片，并以醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染法染色，最后使用JEM1200電鏡觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 遵義和宣城兩地太子參田間生長比較

通過觀察貴州遵義和安徽宣城的太子參田間生長情況發(fā)現(xiàn)，太子參的葉片在3月出苗到5月中旬的幼苗呈翠綠色，5月下旬后的太子參成苗隨著天氣溫度的增加葉片逐漸變黃，但安徽宣城的情況更為快速、嚴重（圖1A）。此外，宣城的太子參在5月底開始發(fā)生大面積爛苗情況，到6月末太子參植株的地上部分基本全部消失（圖1A）。貴州遵義的太子參田間爛苗情況較輕，到7月后的收獲期太子參整株仍然保持存活狀態(tài)，但葉片基本全部黃化。氣象數(shù)據(jù)顯示，2個地點在3—5月間的最低氣溫、最高氣溫、以及相對濕度的差異較小，但安徽宣城在3—5月的陰雨天數(shù)量明顯比貴州遵義少（表1），即安徽宣城的太子參在這段時間接受了更強的光照；而在6月間安徽宣城的陰雨天數(shù)量及氣溫均高于貴州遵義。基于這些觀察數(shù)據(jù)以及太子參的自然喜陰生長習性，推測宣城太子參葉片的快速脫綠黃化可能與3—5月的光照強度有關(guān)，而后期的氣溫升高和陰雨增加則促進了植株的腐爛凋亡。

圖1 遵義與宣城的太子參田間生長情況比較

表1 宣城和遵義的天氣因子比較

另一方面，在安徽宣城的太子參田觀察發(fā)現(xiàn)，凋亡太子參植株的葉片表面大多存在真菌病害的生長痕跡（圖1A）。真菌的生長與葉片碳水化合物含量具有很大關(guān)聯(lián)[15-17]，這一現(xiàn)象促使筆者進行太子參葉片的碳水化合物含量測定。對4月下旬及5月下旬太子參葉片的碳水化合物含量檢測發(fā)現(xiàn)，4月下旬取樣的安徽宣城和貴州遵義的太子參葉片在可溶性糖和淀粉含量方面無明顯差別，但5月下旬在安徽宣城取樣的太子參葉片的可溶性糖和淀粉含量均高于同期在貴州遵義取樣的太子參葉片（圖1B、1C）。

2.2 溫室條件下不同光照強度對太子參葉片發(fā)育的影響

光照是影響碳水化合物代謝的關(guān)鍵因子。為進一步分析光照對太子參葉片黃化及葉片碳水化合物累積的影響，在25℃的人工氣候室比較了不同光照強度下太子參葉片的發(fā)育差異。在實驗過程中，太子參苗被分別置于100、200、300 μmol/(m2·s)的光照強度下進行培養(yǎng)，并于4周后進行葉片顏色觀察及碳水化合物含量的測定。各光照強度下的紫外光及藍光水平如表2所示。

表2 溫室培養(yǎng)太子參在不同光照下的葉色變化 μmol/(m2·s)

研究結(jié)果表明，在光照強度為100 μmol/(m2·s)條件下培養(yǎng)的太子參葉片顏色呈綠色；在光照強度為200 μmol/(m2·s)條件下培養(yǎng)的太子參葉片顏色明顯變黃；而在光照強度為 300 μmol/(m2·s)條件下培養(yǎng)的太子參葉片出現(xiàn)脫綠現(xiàn)象，部分葉片甚至完全脫綠（圖2A）。碳水化合物含量測定結(jié)果（圖2B、2C）顯示，不同光照條件下生長的太子參葉片中的可溶性糖及淀粉含量存在明顯差異。100 μmol/(m2·s)光照條件下培養(yǎng)的太子參葉片中的可溶性糖和淀粉含量均低于10 mg/g；200 μmol/(m2·s)光照條件下培養(yǎng)的太子參葉片中的可溶性糖、淀粉含量約為15、24 mg/g；300 μmol/(m2·s)光照條件下培養(yǎng)的太子參白色葉片的可溶性糖、淀粉含量約為43、90 mg/g。上述結(jié)果表明高光照強度在誘導太子參葉片脫綠過程發(fā)揮重要作用。

圖2 不同光照強度下溫室培養(yǎng)太子參苗的生長情況

2.3 強光促進太子參葉片顏色變化的機理研究

為探明光照影響太子參葉片顏色及碳水化合物含量變化的原因，利用透射電鏡對安徽宣城和貴州遵義大田種植太子參在5月中旬的葉片進行了顯微觀察，以比較其結(jié)構(gòu)差異。如圖3A所示，與遵義的太子參葉片相比，宣城太子參葉片的葉綠體中的淀粉顆粒明顯偏大。隨后，利用透射電鏡對溫室培養(yǎng)太子參在不同光照條件下的葉片結(jié)構(gòu)進行顯微觀察。如圖3B所示，100 μmol/(m2·s)光照條件下培養(yǎng)的太子參葉片（嫩綠色）的葉綠體中的淀粉顆粒少而小，200 μmol/(m2·s)光照條件下培養(yǎng)的太子參葉片（黃綠色）的葉綠體中的淀粉顆粒數(shù)量較多且顆粒較大，300 μmol/(m2·s)光照條件下培養(yǎng)的太子參葉片（脫綠）的葉綠體中的淀粉顆粒數(shù)量較多且顆粒巨大，導致葉綠體片層消失。上述結(jié)果表明，光照強度的增加促進了太子參葉片葉綠體中的淀粉累積，導致葉綠體結(jié)構(gòu)變化，從而引起葉片顏色變化。

圖3 太子參葉片的透射電鏡觀察

2.4 光照誘導太子參葉片黃化過程的氮素調(diào)節(jié)

為研究利用氮素調(diào)控光照誘導太子參葉片黃化過程的可能性，利用磷、鉀含量一致（磷0.07%、鉀0.03%），但氮素含量不同的培養(yǎng)基質(zhì)在實驗溫室比較了太子參在200 μmol/(m2·s)光照條件下的生長差異。在培養(yǎng)3周后，含氮0.12%的培養(yǎng)基質(zhì)中生長的太子參葉片呈黃綠色，植株相對矮小，單株質(zhì)量約1 g；而含氮2.40%的培養(yǎng)基質(zhì)中生長的太子參葉片呈嫩綠色，植株明顯高大，單株質(zhì)量約2.5 g（圖4A～B）。碳水化合物含量測定顯示，含氮0.12%培養(yǎng)基質(zhì)培養(yǎng)的太子參葉片可溶性糖、淀粉含量約為38、75 mg/g，而含氮2.40%培養(yǎng)基質(zhì)培養(yǎng)的太子參葉片可溶性糖、淀粉含量約為7、20 mg/g（圖4C～D）。這些結(jié)果表明，增加氮素施用量在促進植株生長的同時可降低太子參葉片的碳水化合物累積，并抑制光照誘導的葉片黃化。

圖4 不同氮素條件下太子參苗的生長情況

3 結(jié)論

研究表明，太子參種植過程中的強光照導致太子參葉片黃化，其發(fā)生機制是強光照導致的淀粉累積改變了葉綠體的結(jié)構(gòu)，增加土壤中的氮素含量可以抑制光照引起的太子參葉片黃化發(fā)生，該研究可為太子參生產(chǎn)上的農(nóng)藝措施調(diào)控提供一定指導。

4 討論

野生太子參為多年生植物，其生命周期約為4～7年[18]，而人工栽培的太子參通常在秋末播種，翌年夏末收獲，生長周期短，已成為當前市場的主要供給方式[19]。在人工種植過程中，植物葉片的黃化凋亡是影響太子參生產(chǎn)的一大難題。本研究針對這一問題進行了田間調(diào)研及生理分析，對光照在太子參葉片黃化過程的作用機制進行了揭示，對太子參的生產(chǎn)實踐具有參考價值。

在生產(chǎn)上，安徽宣城種植的太子參極易在夏季發(fā)生葉片快速黃化凋亡現(xiàn)象，其產(chǎn)量也遠低于夏季葉片黃化較輕的貴州遵義太子參，比較兩地的太子參生長差異有助于揭示太子參葉片黃化的發(fā)生機制。在比較兩地太子參生長的田間差異時，本研究發(fā)現(xiàn)光照與太子參葉片黃化存在極大關(guān)聯(lián)。室內(nèi)試驗結(jié)果也表明，弱光照射下生長的太子參葉片顏色呈鮮綠色，強光照射下生長的太子參葉片顏色明顯變黃，說明光照在太子參葉片黃化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。前期報道，遮陰處理能夠提高太子參葉片葉綠素含量，是防治強光照下太子參枯苗的重要措施[13]，將太子參和其他作物進行套種，種植在喬木林下，或者在太子參田放置遮陽網(wǎng)，以阻止太陽光直射，也可以起到遮蔭及增產(chǎn)的目的[1]。這些農(nóng)藝措施與本研究所發(fā)現(xiàn)的光誘導太子參葉片黃化具有高度一致性。

葉片的顏色與內(nèi)部的葉綠體結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[20-21]。對太子參葉片的透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，強光照射下生長的太子參葉片葉綠體中的淀粉顆粒在數(shù)量和體積上均得到顯著增加，而且強光照還會導致淀粉顆粒完全占據(jù)葉綠體，破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，引起葉片脫綠。葉綠體是葉片合成碳水化合物的主要場所，光照對葉綠體發(fā)育的影響也會引起葉片的碳水化合物含量變化[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，強光照可以增加太子參葉片的可溶性糖及淀粉等碳水化合物含量。對安徽宣城和貴州遵義的太子參葉片檢測也表明，太子參葉片的碳水化合物含量與接受的光照強度呈正比，宣城的太子參葉片在5月前累積了更多的碳水化合物。這些現(xiàn)象說明光照是引起宣城太子參葉片過早黃化的原因，而高水平的碳水化合物累積對高溫高濕天氣的葉片腐爛起到促進作用。氮素是影響植物葉片發(fā)育的重要因子，增加氮肥用量可以改變?nèi)~片結(jié)構(gòu)，使葉片變綠[22-23]。本研究證明，高氮素培養(yǎng)基質(zhì)可以有效抑制高光強導致的太子參葉片黃化，這一結(jié)果與前人報道多施肥可以改善太子參生長的結(jié)論一致[2,24-25]。

本研究初步分析了光照引起太子參葉片黃化凋亡過程所發(fā)生的生理變化和可行的調(diào)控方式，在未來的研究中還需要進一步開展分子水平的作用機制解析，為適合人工栽培的太子參品種選育和太子參種植過程的生物調(diào)控措施開發(fā)提供參考。