李軍鴿，王永春，孟珈同，邱智東，唐秋竹

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)·吉林長(zhǎng)春·130117）

黃連解毒湯最早記載于東晉葛洪撰寫的《肘后備急方》，后由唐代王燾在《外臺(tái)秘要》第一卷崔氏方一十五首中命名為黃連解毒湯[1-4]，原文“黃連三兩，黃芩，黃柏各二兩，梔子十四杖擘，以水六升，煮取二升”，黃連解毒湯為清熱解毒的經(jīng)典名方，其主要功效為清熱解毒。 主治三焦實(shí)熱火毒證[5]。 現(xiàn)代研究表明其具有抗炎、保護(hù)心血管、保護(hù)胃腸粘膜、調(diào)血脂、降血糖等作用[6-10]，因其功效廣泛，療效顯著，臨床一直在沿用。 黃連解毒湯為四味藥組成的復(fù)方，其化學(xué)成分相對(duì)簡(jiǎn)單，主要為生物堿和黃酮類成分， 本研究通過(guò)測(cè)定黃連解毒湯中鹽酸小檗堿、黃芩苷、黃柏堿、梔子苷這些主要化學(xué)成分含量，以期為經(jīng)典名方-黃連解毒湯開發(fā)及質(zhì)量控制研究提供參考。

1 材料與儀器

1.1 藥材飲片

黃連飲片 （吉林省北藥藥材加工有限公司批號(hào)：20210511）；黃芩飲片（吉林省北藥藥材加工有限公司批號(hào)：20201005）；黃柏飲片（吉林省北藥藥材加工有限公司批號(hào)：20200712）；梔子飲片（吉林省北藥藥材加工有限公司批號(hào)：20201115）； 以上藥材飲片經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)翁麗麗教授鑒定及檢驗(yàn)均合格。

1.2 儀器與試藥

高效液相色譜儀（島津LC2030）；真空冷凍干燥機(jī)（Epsilon 2-4 LSCplus）； 超聲波清洗機(jī) （昆山KQ-250B）；萬(wàn)分之一電子天平（梅特勒XS105DU）；鹽酸小檗堿對(duì)照品 （中國(guó)食品藥品檢定研究院，111638-201907）； 黃柏堿對(duì)照品 （中國(guó)食品藥品檢定研究院，111895-201805）；黃芩苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，110715-201318）；梔子苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，110749-201919）；甲醇、乙腈（Fisher，色譜純）；水為超純水；其它試劑均為分析純。

2 方法

2.1 黃連解毒湯樣品制備

《外臺(tái)秘要》記載“黃連三兩，黃芩，黃柏各二兩，梔子十四杖擘，以水六升，煮取二升，分二服”。 唐“一兩”折合現(xiàn)代13.8g，唐“一升” 折合現(xiàn)代200mL[11-12]，故折算后取黃連41.4g、黃芩27.6g、黃柏27.6g、梔子15g、加水1200mL，用武火保持沸騰，后文火煎煮，煎煮40 分鐘，用雙層200 目紗布趁熱過(guò)濾，得藥液400mL，冷凍干燥72h，得凍干粉，平行制備4 份，備用。

2.2 含量測(cè)定[13-20]

2.2.1 對(duì)照品溶液制備

分別取鹽酸小檗堿、黃柏堿、黃芩苷、梔子苷對(duì)照品， 精密稱定， 加甲醇分別制成每1mL 含90μg、100μg、60μg、30μg 的對(duì)照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液制備

2.2.2.1 鹽酸小檗堿含量測(cè)定

精密稱定凍干粉樣品0.5g， 精密加甲醇-鹽酸（100∶1）的混合液50mL，密塞，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷，甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，過(guò)濾，精密吸取續(xù)濾液1mL，置10mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，備用。

2.2.2.2 黃芩苷含量測(cè)定

精密稱定凍干粉樣品0.5g， 精密加70%乙醇100mL，密塞，稱定重量，加熱回流3 小時(shí)，放冷，70%乙醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，過(guò)濾，精密吸取續(xù)濾液1mL，置5mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，備用。

2.2.2.3 黃柏堿、梔子苷含量測(cè)定

精密稱定凍干粉樣品0.5g， 精密加甲醇25mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 分鐘，放冷，甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，備用。

2.2.3 色譜條件

2.2.3.1 小檗堿含量測(cè)定

Apollo C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）,流動(dòng)相為乙腈-0.05mol/L 磷酸二氫鉀 （以磷酸調(diào)pH 為4.0）（25∶75），檢測(cè)波長(zhǎng)354nm，柱溫35℃，各對(duì)照品進(jìn)樣量5μL，供試品10μL。

2.2.3.2 黃芩苷含量測(cè)定

Apollo C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）,流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸水（47∶53），檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，柱溫35℃，對(duì)照品和供試品進(jìn)樣量10μL。

2.2.3.3 黃柏堿含量測(cè)定

Apollo C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）,流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水（13∶87），檢測(cè)波長(zhǎng)284nm，柱溫35℃，對(duì)照品和供試品進(jìn)樣量10μL。

2.2.3.4 梔子苷含量測(cè)定

Techmate C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）,流動(dòng)相為乙腈-水（13∶87），檢測(cè)波長(zhǎng)238nm，柱溫35℃，對(duì)照品進(jìn)樣量5μL，供試品10μL。

3 結(jié)果

3.1 專屬性

分別吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液，分別按2.2.3色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，詳見圖1-4，對(duì)照品色譜圖與供試品色譜圖相同保留時(shí)間處都有相應(yīng)色譜峰，分離度符合要求，陰性樣品溶液無(wú)干擾，說(shuō)明各方法專屬性好。

圖1 黃連解毒湯中鹽酸小檗堿含量測(cè)定色譜圖

圖2 黃連解毒湯中黃芩苷含量測(cè)定色譜圖

圖3 黃連解毒湯中黃柏堿含量測(cè)定色譜圖

圖4 黃連解毒湯中梔子苷含量測(cè)定色譜圖

3.2 線性

取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液（0.3718 mg/mL）分別加甲 醇 稀 釋 成0.0186、0.0372、0.0744、0.0930、0.1115、0.1859mg/mL 濃度的對(duì)照品溶液， 取黃芩苷對(duì)照品溶液（0.1854 mg/mL）分別加甲醇稀釋成0.0154、0.0309、0.0618、0.0927、0.1236mg/mL 濃度對(duì)照品溶液，取黃柏堿對(duì)照品溶液 （0.1912 mg/mL） 分別加甲醇稀釋成0.0239、0.0478、0.0717、0.0956、0.1434mg/mL 濃度的對(duì)照品溶液，取梔子苷對(duì)照品溶液（0.2262mg/mL）分別加甲醇稀釋成0.0188、0.0377、0.0753、0.1131、0.1506mg/mL 濃度的對(duì)照品溶液，各精密吸取不同濃度鹽酸小檗堿和梔子苷對(duì)照品溶液5μL， 黃芩苷和黃柏堿10μL，測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（X），峰面積值為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性關(guān)系考察，結(jié)果見表1，可知各化學(xué)成分在相應(yīng)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表1 線性考察結(jié)果

3.3 精密度

取黃連解毒湯凍干粉樣品按2.2.2 方法分別制備供試品溶液， 按2.2.3 色譜條件各連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，每次進(jìn)樣5 μL，記錄色譜峰面積值，鹽酸小檗堿RSD為0.48 %、黃芩苷RSD 為0.55 %、黃柏堿RSD 為0.66%、梔子苷RSD 為0.83 %，結(jié)果表明儀器精密度良好。

3.4 重復(fù)性

取黃連解毒湯凍干粉樣品6 份，按2.2.2 方法分別制備供試品溶液， 按2.2.3 色譜條件分別測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。 結(jié)果鹽酸小檗堿含量53.47 mg/g，RSD 為1.97 %；黃芩苷含量89.30 mg/g，RSD 為1.76 %；黃柏堿含量3.54 mg/g，RSD 為2.01 %； 梔子苷含量21.88 mg/g，RSD 為1.38 %。 表明該方法重現(xiàn)性良好。

3.5 穩(wěn)定性

取黃連解毒湯凍干粉樣品， 精密稱定0.5g，按2.2.2 方法分別制備供試品溶液， 按2.2.3 色譜條件分別測(cè)定峰面積，進(jìn)樣量為5μL，分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)行測(cè)定，紀(jì)錄峰面積，結(jié)果顯示鹽酸小檗堿、黃芩苷、 黃柏堿、 梔子苷峰面積的RSD 分別為1.88 %、1.96%、1.93%、1.74%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

3.6 加樣回收率

取已知鹽酸小檗堿含量的黃連解毒湯凍干粉6份，每份0.25g，精密稱定，各精密加入50ml 鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品（濃度為0.2690mg/mL），按照2.2.2.1 鹽酸小檗堿含量測(cè)定方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，回收率平均值為100.37%，RSD 為2.43 %，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見表2。

表2 鹽酸小檗堿加樣回收率結(jié)果

取已知黃芩苷含量的黃連解毒湯凍干粉6 份，每份0.25g，精密稱定，各精密加入100ml 黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液（濃度為0.2224mg/mL），按照2.2.2.2 黃芩苷含量測(cè)定方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，回收率平均值為99.06%，RSD 為1.41%， 結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見表3。

表3 黃芩苷加樣回收率結(jié)果

取已知黃柏堿含量的黃連解毒湯凍干粉6 份，每份0.25g，精密稱定，各精密加入25ml 黃柏堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液（濃度為0.0424mg/mL），按照2.2.2.3 黃柏堿含量測(cè)定方法制備供試品溶液， 依法測(cè)定， 回收率平均值為99.94%，RSD 為1.86%， 結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見表4。

表4 黃柏堿加樣回收率結(jié)果

取已知梔子苷含量的黃連解毒湯凍干粉6 份，每份0.25g， 精密稱定， 各精密加入25ml 梔子苷標(biāo)準(zhǔn)品（濃度為0.2225mg/mL）， 按照2.2.2.3 梔子苷含量測(cè)定方法制備供試品溶液， 依法測(cè)定， 回收率平均值為99.40%，RSD 為2.28 %，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見表5。

表5 梔子苷加樣回收率結(jié)果

3.7 含量測(cè)定

取黃連解毒湯凍干粉三批樣品，分別按2.2.2 各方法制備供試品溶液， 按2.2.3 色譜條件分別測(cè)定峰面積，計(jì)算鹽酸小檗堿、黃芩苷黃柏堿、梔子苷含量，結(jié)果見表6。

表6 黃連解毒湯三批樣品各成分含量測(cè)定結(jié)果

4 討論

4.1 測(cè)定指標(biāo)的選擇

黃連解毒湯由黃連、 黃芩、 黃柏和梔子四味藥組成，主要化學(xué)成分有為物堿、黃酮類、環(huán)烯醚萜苷類等，這些成分相互作用，共同發(fā)揮藥效[21]，其中黃連還含有表小檗堿、黃連堿、巴馬汀等生物堿[22]，前期通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，表小檗堿、黃連堿、巴馬汀含量較低，可能會(huì)導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果誤差較大，故沒(méi)有將表小檗堿、黃連堿、巴馬汀作為指標(biāo)成分。黃柏除了含有黃柏堿外，還含有鹽酸小檗堿， 故本研究黃連解毒湯中鹽酸小檗堿來(lái)源于黃連和黃柏， 黃芩苷和梔子苷是黃芩和梔子發(fā)揮藥效的主要成分，其含量測(cè)定方法比較成熟，對(duì)照品易得，再參考2020 版《中國(guó)藥典》一部各藥材項(xiàng)下的含量測(cè)定成分，故確定選擇鹽酸小檗堿、黃芩苷、黃柏堿、梔子苷為黃連解毒湯主要成分。

4.2 樣品的提取

黃芩苷含量測(cè)定比較了超聲和回流提取方法，結(jié)果回流提取方法測(cè)得的含量高于超聲提取方法， 故黃芩苷含量測(cè)定選擇回流提取， 其他成分含量測(cè)定超聲提取與回流提取相差不多，故鹽酸小檗堿、黃柏堿、梔子苷為超聲提取；另外通過(guò)單因素考察，以各含量為指標(biāo)，對(duì)提取時(shí)間和提取溶劑量進(jìn)行考察，最終確定鹽酸小檗堿超聲提取30 分鐘，提取溶劑量為50mL，黃芩苷回流3 小時(shí)，提取溶劑量為100mL，黃柏堿和梔子苷超聲提取30 分鐘，提取溶劑量為25mL。

4.3 色譜條件的選擇

參考《中國(guó)藥典》2020 版和相關(guān)文獻(xiàn)[13-16]中各成分含量測(cè)定流動(dòng)相組成，并對(duì)其比例進(jìn)行考察篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以上各成分保留時(shí)間適中，峰型較好，與其他雜峰分離度大于1.5。 因此， 鹽酸小檗堿以乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鉀（25∶75）為流動(dòng)相，黃芩苷以甲醇-0.2%磷酸水（47∶53）為流動(dòng)相，黃柏堿以乙腈-0.1%磷酸水（13∶87）為流動(dòng)相，梔子苷以乙腈-水（13∶87）為流動(dòng)相，同時(shí)分別對(duì)25、30、35℃柱溫，0.8、1.0、1.2mL/min 流速等色譜條件進(jìn)行了考察， 最終確定各成分測(cè)定流速為1.0mL/min，柱溫都為35℃。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本研究各方法方便快速、靈敏度高、專屬性強(qiáng)，適合用于黃連解毒湯中鹽酸小檗堿、黃芩苷、黃柏堿、梔子苷含量測(cè)定，為經(jīng)典名方-黃連解毒湯開發(fā)及質(zhì)量控制研究提供參考。