展 月，趙 俞，鄢必新，劉 鑫，徐 云，秦思蓮，李生勇，王 鑫*

（1.吉林修正藥業(yè)新藥開發(fā)有限公司，長(zhǎng)春130103；2. 修正藥藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，通化134001）

梔子為茜草科植物梔子Gardenia jasminoides Ellis 的干燥成熟果實(shí)，味苦，性寒；歸心、肺及三焦經(jīng)；具有瀉火除煩，清熱利濕，涼血解毒；外用消腫止痛的功效；臨床主要用于熱病心煩，濕熱黃疸，淋證澀痛，血熱吐衄，目赤腫痛，火毒瘡瘍；外治扭挫傷痛等癥。現(xiàn)代藥理表明梔子中含多種化學(xué)成分，包括環(huán)烯醚萜苷類、三萜類、黃酮類、有機(jī)酸酯類等，其中山梔苷、梔子苷等環(huán)烯醚萜苷類成分為梔子的主要有效成分。 本研究采用HPLC 法，建立梔子飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體、配方顆粒指紋圖譜，評(píng)價(jià)其相關(guān)性，為梔子配方顆粒制備全過程的質(zhì)量控制提供科學(xué)參考依據(jù)[1]。

1 材料

1.1 試劑

乙腈、甲酸為色譜純；甲醇為分析純；水為純化水。

1.2 儀器

AE205DU 型分析天平 （上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-300DE 型數(shù)控超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；Ultimate 3000 高效液相色譜儀DAD 檢測(cè)器。

1.3 試藥

梔子飲片15 批（4 批購(gòu)自江西臨川批號(hào)：YC040-161010、YC009 -160904、YC009 -161008、YC009 -161009；3 批購(gòu)自湖南平江：YC009-161005、YC009-161006、YC009-161007；4 批購(gòu)自湖北宜昌：YC009-170411、YC009 -170412、YC009 -170413、YC009 -170414；4 批購(gòu)自江西樟樹：YC009-160901、YC009-160902、YC009-170416、YC009-170417）；梔子對(duì)照藥材 （批號(hào)：120986-201309）； 梔子苷對(duì)照品 （批號(hào)：110749-201316）、 雞矢藤次苷甲酯 （批號(hào)：110749-201316）、羥異梔子苷（批號(hào)：110749-201316）、Jasminoside B（批號(hào)：110749-201316）、京尼平-1-龍膽二糖苷（批號(hào)：110749-201316）、山梔子苷（批號(hào)：110749-201316）、苦藏花素（批號(hào)：110749-201316），購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 梔子片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體、配方顆粒中梔子苷含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性[2-3]

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑； 以乙腈-水(15∶85 ) 為流動(dòng)相，流速為1.0mL/min，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)238nm，進(jìn)樣量10μL。 理論板數(shù)按梔子苷峰計(jì)算應(yīng)不低于1500。

2.1.2 溶液制備

2.1.2.1 對(duì)照品溶液制備

取梔子苷對(duì)照品適量， 精密稱定， 加甲醇制成每1ml 分別含30μg 的溶液，即得。

2.1.2.2 供品溶液制備

梔子飲片供試品溶液的制備同2020 《中國(guó)藥典》梔子飲片項(xiàng)下方法，梔子標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體、配方顆粒供試品制備方法: 取本品約0.1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率40kHz）30 分鐘，取出，放冷，再稱定重量，再用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液3ml，置25ml 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2.3 樣品含量測(cè)定

結(jié)果見表1， 梔子飲片中梔子苷含量均大于1.5%，符合《中國(guó)藥典》2020 年版一部 “梔子” 項(xiàng)下有關(guān)的各項(xiàng)規(guī)定。通過對(duì)15 批梔子飲片及其制備的標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉、中間體、成品梔子苷含量測(cè)定研究，梔子苷含量范圍為12.0%～17.6%，平均含量為14.8%，中間體（干膏粉） 梔子苷含量范圍為13.1%～17.6%， 平均含量為14.5%，配方顆粒梔子苷含量范圍為9.1%～15.9%，平均含量為12.6%，

從表1 數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn)梔子標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體、配方顆粒，梔子苷含量相差小于±3，說明三者含量基本一致，梔子標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率范圍為19.1～29.0%，梔子苷轉(zhuǎn)移率范圍為57.0～85.2%，梔子中間體的浸膏收率范圍為17.2～28.0%，梔子苷轉(zhuǎn)移率范圍為61.0～73.2%，均在梔子標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率及梔子苷轉(zhuǎn)移率范圍之內(nèi)， 說明梔子配方顆粒制備工藝合理， 因梔子配方顆粒在制備過程中加入輔料，故梔子苷含量較中間體低。

表1 梔子飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體、配方顆粒中梔子苷含量

2.2 梔子飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體、配方顆粒HPLC 指紋圖譜的建立

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Kromasil 100-5-C18( 250mm×4.6 mm，5μm)；流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，以0.5%甲酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～10min，1%A→4%A；10～25min，4%A；25～50min，4%A→8%A；50～55min，8%A→10%A；55～65min，10%A→12%A；65～80min，12%A。 ） 流速為1ml/min； 檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm； 柱溫為35℃， 進(jìn)樣量：10μl。 理論板數(shù)按梔子苷峰計(jì)算應(yīng)不低于1500。

2.2.2 參照物溶液制備

取山梔子苷、雞矢藤次苷甲酯、羥異梔子苷、Jasminoside B、京尼平-1-龍膽二糖苷、梔子苷、苦藏花素適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1ml 分別含0.2mg的混合溶液，即得。取梔子對(duì)照藥材約0.3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率40kHz）30 分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 供試品溶液制備方法[4,5]

梔子飲片：取本品粉末（過四號(hào)篩）約0.3g，精密稱定， 精密加甲醇50ml， 稱定重量， 超聲處理 （功率250W，頻率40kHz）30 分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，即得。

梔子標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒、中間體：取本品約0.1g，精密稱定， 置具塞錐形瓶中， 精密加入甲醇50ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率40kHz）30分鐘，取出，放冷，再稱定重量，再用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液3ml，置25ml 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)

取同一批梔子標(biāo)準(zhǔn)湯劑，按照2.2.3 項(xiàng)下條件制備供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD＜3%， 表明精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次梔子標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品6 份，按照2.2.3項(xiàng)下條件制備供試品溶液， 結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD＜3% ，表明重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批次梔子標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品，按2.2.3 項(xiàng)下制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24、48h 進(jìn)樣，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD＜3%， 表明供試品溶液在48h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 樣品的測(cè)定

取15 批梔子飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體、配方顆粒供試品溶液10μL， 參照物溶液， 按照2.2.1 項(xiàng)下條件檢測(cè)。 詳見圖1-4。

圖1 梔子飲片HPLC 指紋圖譜共有模式圖

圖2 梔子標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC 指紋圖譜及其對(duì)照指紋圖譜

圖3 梔子配方顆粒中間體HPLC 指紋圖譜及其對(duì)照指紋圖譜

圖4 梔子配方顆粒HPLC 指紋圖譜及其對(duì)照指紋圖譜

2.5 共有峰標(biāo)定

將15 批梔子飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體、配方顆粒HPLC 指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入 “中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”( 2012 版) 選擇時(shí)間寬度為0.1，中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜，經(jīng)比較分析后確定梔子飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體、配方顆粒均有9 個(gè)共有峰。 15 批梔子飲片、中間體、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒指紋圖譜相似度范圍在0.9～1。 各批次供試品指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行比較，計(jì)算其相似度，結(jié)果見表2。 結(jié)果顯示，15 批飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體、配方顆粒指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度均在0.9 以上，說明15 批不同產(chǎn)地的梔子飲片化學(xué)成分具有良好的相似性； 梔子配方顆粒生產(chǎn)工藝穩(wěn)定。 與山梔子苷、雞矢藤次苷甲酯、羥異梔子苷、Jasminoside B、京尼平-1-龍膽二糖苷、梔子苷、苦藏花素對(duì)照品色譜圖進(jìn)行對(duì)比，確認(rèn)配方顆粒HPLC 指紋圖譜中1 號(hào)峰為山梔子苷、2 號(hào)峰為雞矢藤次苷甲酯、3 號(hào)峰為羥異梔子苷、4 號(hào)峰為Jasminoside B、5 號(hào)峰為京尼平-1-龍膽二糖苷、6 號(hào)峰為梔子苷7 號(hào)峰為苦藏花素；結(jié)果見圖5。

表2 15 批梔子飲片、中間體、標(biāo)準(zhǔn)湯劑及配方顆粒的指紋圖譜相似度

圖5 共有峰指認(rèn)

2.6 相關(guān)性分析

梔子飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體、配方顆粒HPLC 對(duì)照指紋圖譜比較結(jié)果見圖6， 并采用相似度評(píng)價(jià)軟件評(píng)價(jià)四者圖譜的相似度，結(jié)果見表3，結(jié)果表明梔子配方顆粒的9 個(gè)共有特征峰在梔子標(biāo)準(zhǔn)湯劑、飲片、中間體中均有顯示，由表3 可以看出梔子配方顆粒對(duì)照指紋圖譜與飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體的對(duì)照指紋圖譜相似度在0.9 以上，結(jié)合15 批梔子飲片、中間體、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒指紋圖譜相似度范圍在0.9～1，說明梔子配方顆粒和梔子飲片、中間體、標(biāo)準(zhǔn)湯劑成分一致，四者指紋圖譜具有良好的相關(guān)性， 為采用HPLC 指紋圖譜對(duì)梔子配方顆粒生產(chǎn)全過程進(jìn)行控制提供試實(shí)驗(yàn)依據(jù)[6]。

表3 梔子飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體、配方顆粒HPLC 對(duì)照指紋圖譜相似度結(jié)果

圖6 梔子飲片(1) 、標(biāo)準(zhǔn)湯劑(2) 、中間體(3) 及配方顆粒(4) 的HPLC 對(duì)照指紋圖譜比較