高曉麗*，楊東

呂梁學(xué)院生命科學(xué)系（呂梁 033001）

我國(guó)是世界上馬鈴薯總產(chǎn)量最多的國(guó)家，種植區(qū)域分布廣泛[1]。馬鈴薯含有非常豐富的膳食纖維，而膳食纖維被稱(chēng)為“第七大營(yíng)養(yǎng)素”，合理攝入能降低膽固醇、血糖、血脂，減少肥胖和心血管疾病以及某些胃腸道疾病的發(fā)生[2-3]。我國(guó)大部分馬鈴薯都是簡(jiǎn)單的粗加工，這使其綜合經(jīng)濟(jì)效益受到很大的影響，因此高效提取馬鈴薯中的膳食纖維可以有效提高資源的利用率，具有一定的社會(huì)效益。

馬鈴薯膳食纖維中纖維素和半纖維素含量較高，木質(zhì)素含量相對(duì)較低，具有更好的柔性，是制備高品質(zhì)膳食纖維的良好原料[4]。目前馬鈴薯中膳食纖維的提取方法主要有化學(xué)法、酶法、酶堿法和發(fā)酵法等[5]。在這些方法中，酶法提取條件溫和，專(zhuān)一性強(qiáng)，產(chǎn)品純度高，品質(zhì)較好而且節(jié)約能源，對(duì)環(huán)境污染較小，是常用的提取膳食纖維的方法之一[6]。

目前國(guó)內(nèi)關(guān)于用酶法提取膳食纖維的研究多集中于對(duì)酶添加量、溫度、pH和料液比等因素方面，且多采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)進(jìn)行提取工藝的優(yōu)化，而對(duì)于酶的添加量、酶的作用時(shí)間以及不同酶之間這些因素的交互影響的研究尚少。用α-淀粉酶和木瓜蛋白酶從馬鈴薯中提取膳食纖維，對(duì)不同酶的添加量和作用時(shí)間的各自影響以及彼此之間的交互影響進(jìn)行研究，并采用響應(yīng)面法進(jìn)行工藝的優(yōu)化，確定酶法提取馬鈴薯膳食纖維的最佳工藝條件，以期為馬鈴薯膳食纖維提取工藝的進(jìn)一步優(yōu)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鈴薯，市售；無(wú)水乙醇（分析純），天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；丙酮（分析純），洛陽(yáng)市化學(xué)試劑廠；鹽酸、氫氧化鈉（分析純），天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；α-淀粉酶、木瓜蛋白酶，蘇仟泊生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

VIS-723N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海佑科分析儀器儀表有限公司；ZN-08粉碎機(jī)，北京興時(shí)利和科技發(fā)展有限公司；HH-6恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司；DZF-6021真空干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；XK78-1磁力攪拌器，姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司；SHB-Ⅲ真空抽濾機(jī)，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；SC-04低速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；PHS-2S型pH計(jì)，上海越平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

新鮮馬鈴薯洗凈、切塊，用打漿機(jī)打碎，用紗布包裹并用水沖洗，干燥后用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)0.250 mm孔徑篩，密封備用。

1.3.2 膳食纖維提取[7-9]

稱(chēng)取1 g樣品（M1），加入25 mL蒸餾水和一定量α-淀粉酶，調(diào)pH至6.5，加蓋鋁箔，于60 ℃水浴一定時(shí)間，然后100 ℃下保持8 min滅酶。冷卻后再加入木瓜蛋白酶，調(diào)節(jié)pH至6.5，充分混勻，于60 ℃水浴加熱一定時(shí)間，然后轉(zhuǎn)移至100 ℃加熱保持8 min滅酶，冷卻后離心，在4 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心15 min。離心后取上清液進(jìn)行濃縮，加入4倍體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，預(yù)熱到50 ℃，靜置1.5 h后離心，在4 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心20 min，然后置于60 ℃條件下烘干，稱(chēng)其質(zhì)量（M2）。將離心后的沉淀用體積分?jǐn)?shù)為78%乙醇、體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇及丙酮洗滌殘?jiān)?，洗滌后抽濾去除洗滌液，將殘?jiān)娓桑?05 ℃）至恒重，稱(chēng)其質(zhì)量（M3）。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

以α-淀粉酶添加量、α-淀粉酶作用時(shí)間、木瓜蛋白酶添加量和木瓜蛋白酶作用時(shí)間為影響因素，提取時(shí)只改變一個(gè)因素，保持其余三個(gè)因素水平不變，以馬鈴薯膳食纖維提取率為評(píng)價(jià)依據(jù)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。具體方案見(jiàn)表1。

表1 單因素試驗(yàn)水平選取表

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的結(jié)果上，選取合適水平，運(yùn)用四因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法，以α-淀粉酶添加量（A）、α-淀粉酶作用時(shí)間（B）、木瓜蛋白酶添加量（C）和木瓜蛋白酶作用時(shí)間（D）為自變量，以馬鈴薯膳食纖維提取率Y為響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

1.3.5 膳食纖維提取率計(jì)算

式中：Y為提取率，%；M1為試驗(yàn)樣品的質(zhì)量，g；M2為試驗(yàn)樣品中可溶性膳食纖維的質(zhì)量，g；M3為試驗(yàn)樣品中不可溶性膳食纖維的質(zhì)量，g。

1.3.6 性能測(cè)定

溶脹性、持水力與持油力測(cè)定方法參考張華等[10]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1α-淀粉酶添加量對(duì)馬鈴薯膳食纖維提取率的影響

在α-淀粉酶作用時(shí)間120 min、木瓜蛋白酶添加量150 U/g、木瓜蛋白酶酶解時(shí)間90 min的條件下，研究α-淀粉酶添加量對(duì)膳食纖維提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。在α-淀粉酶添加量處于較低水平時(shí)，隨著α-淀粉酶的添加量不斷增加，膳食纖維的提取率不斷上升，在α-淀粉酶添加量為300 U/g時(shí)達(dá)到最高。當(dāng)α-淀粉酶添加量繼續(xù)增加到420 U/g時(shí)，膳食纖維提取率存在小幅度下降，直至趨于穩(wěn)定的現(xiàn)象。導(dǎo)致這種結(jié)果的原因可能是在酶添加量較低時(shí)，添加的酶量不足以完全水解原料中的淀粉物質(zhì)，即淀粉分解不充分，導(dǎo)致膳食纖維分離不完全，因此在酶添加量較低時(shí)膳食纖維的提取率也較低。而在酶添加量較高時(shí)，高濃度的酶會(huì)導(dǎo)致半纖維素等生理活性物質(zhì)發(fā)生降解[4]，使得提取率又出現(xiàn)下降。因此，依據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇240，300和360 U/g這3個(gè)水平。

圖1 α-淀粉酶添加量對(duì)膳食纖維提取率的影響

2.1.2α-淀粉酶作用時(shí)間對(duì)馬鈴薯膳食纖維提取率的影響

在α-淀粉酶添加量300 U/g、木瓜蛋白酶添加量150 U/g、木瓜蛋白酶作用時(shí)間90 min的條件下，研究α-淀粉酶作用時(shí)間對(duì)膳食纖維提取率的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。在α-淀粉酶作用時(shí)間處于較短的時(shí)間水平時(shí)，膳食纖維的提取率隨著α-淀粉酶作用時(shí)間的增加而迅速增高，并在90 min時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)。當(dāng)α-淀粉酶作用時(shí)間繼續(xù)增加時(shí)，膳食纖維的提取率緩慢下降，慢慢趨于穩(wěn)定。導(dǎo)致這種結(jié)果的原因可能是作用時(shí)間較短，反應(yīng)液中淀粉底物充足，分解的一直是淀粉物質(zhì)，膳食纖維不斷被分離出來(lái)，因此膳食纖維的提取率一直上升。隨著作用時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，當(dāng)?shù)矸鄣孜锓纸馔旰?，膳食纖維提取率達(dá)到最大，繼續(xù)增加反應(yīng)時(shí)間導(dǎo)致膳食纖維部分分解，使得提取率出現(xiàn)下降。因此，根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)選取60，90和120 min這3個(gè)水平。

圖2 α-淀粉酶作用時(shí)間對(duì)膳食纖維提取率的影響

2.1.3 木瓜蛋白酶添加量對(duì)馬鈴薯膳食纖維提取率的影響

在α-淀粉酶添加量300 U/g、α-淀粉酶作用時(shí)間120 min、木瓜蛋白酶作用時(shí)間90 min的條件下，研究木瓜蛋白酶添加量對(duì)膳食纖維提取率的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。在木瓜蛋白酶添加量處于較低水平時(shí)，膳食纖維提取率隨著木瓜蛋白酶添加量的增加而增加，并在200 U/g時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)。當(dāng)木瓜蛋白酶添加量繼續(xù)增加至250 U/g時(shí)，膳食纖維提取率出現(xiàn)輕微降低的現(xiàn)象。導(dǎo)致這種結(jié)果的原因可能是酶添加量不足時(shí)，添加的酶不足以完全水解原料中的蛋白質(zhì)，膳食纖維分離不完全，隨著酶添加量的增加，蛋白質(zhì)被完全水解，提取率達(dá)到最高點(diǎn)。當(dāng)酶添加量再增加時(shí)，由于蛋白水解并不增加，但纖維可能有損失，導(dǎo)致膳食纖維提取率出現(xiàn)輕微下降。因此，依據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)選取150，200和250 U/g這3個(gè)水平。

圖3 木瓜蛋白酶添加量對(duì)膳食纖維提取率的影響

2.1.4 木瓜蛋白酶作用時(shí)間對(duì)馬鈴薯膳食纖維提取率的影響

在α-淀粉酶添加量300 U/g、α-淀粉酶作用時(shí)間120 min、木瓜蛋白酶添加量150 U/g的條件下，研究木瓜蛋白酶作用時(shí)間對(duì)膳食纖維提取率的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。在木瓜蛋白酶作用時(shí)間處于30~90 min的較低水平時(shí)，馬鈴薯膳食纖維提取率隨作用時(shí)間的增加而增加，在90 min時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)。隨著木瓜蛋白酶作用時(shí)間繼續(xù)增加至150 min，膳食纖維提取率隨木瓜蛋白酶作用時(shí)間的增加而降低。導(dǎo)致這種結(jié)果的原因可能是作用時(shí)間較短時(shí)，原料中的蛋白質(zhì)充足，酶一直在分解蛋白質(zhì)，膳食纖維不斷被分離出來(lái)，使得膳食纖維的提取率不斷增加，當(dāng)?shù)孜镏械牡鞍踪|(zhì)都分解完后，膳食纖維的提取率達(dá)到最大。繼續(xù)增加反應(yīng)時(shí)間會(huì)導(dǎo)致部分膳食纖維分解，使得提取率出現(xiàn)下降。因此，根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)選取60，90和120 min這3個(gè)水平。

圖4 木瓜蛋白酶作用時(shí)間對(duì)膳食纖維提取率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

通過(guò)單因素試驗(yàn)，找出研究因素的最佳提取參數(shù)范圍，運(yùn)用四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)共進(jìn)行29組試驗(yàn)對(duì)酶法提取膳食纖維進(jìn)行工藝優(yōu)化，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，以獲得其最佳的工藝參數(shù)。因素編碼水平見(jiàn)表2，試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面因素編碼水平設(shè)計(jì)表

運(yùn)用Design-Expert軟件，按照表3中的響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)多項(xiàng)擬合，獲得研究因素與膳食纖維提取率的多元二次回歸方程：

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，其分析結(jié)果見(jiàn)表4及表5 。由表4可知，該模型的p值小于0.01，表明該模型具有高度的顯著性，也表明模型的擬合程度好、精度高，適合用來(lái)描述研究因素與提取率之間的關(guān)系，同時(shí)，也表明可以用此模型來(lái)進(jìn)行膳食纖維提取率的預(yù)測(cè)。在模型中，α-淀粉酶添加量、α-淀粉酶作用時(shí)間和木瓜蛋白酶作用時(shí)間對(duì)膳食纖維提取率的影響非常顯著（p＜0.01）。木瓜蛋白酶添加量對(duì)膳食纖維提取率的影響顯著（p＜0.05），表明研究因素對(duì)于膳食纖維提取率的影響都較大。在因素的交互作用方面，A和C，B和D，C和D的交互作用非常顯著，A和D的交互作用顯著，A和B，B和C的交互作用不顯著。模型的二次項(xiàng)對(duì)膳食纖維提取率的曲面影響均非常顯著。模型的失擬項(xiàng)在α=0.05水平上不顯著（p=0.334 4＞0.05），表明模型比較符合實(shí)際情況，可以用此模型來(lái)預(yù)測(cè)馬鈴薯膳食纖維在研究因素處于各水平時(shí)的提取率。因素的主效應(yīng)關(guān)系為α-淀粉酶作用時(shí)間＞木瓜蛋白酶作用時(shí)間＞α-淀粉酶添加量＞木瓜蛋白酶添加量。

表4 膳食纖維提取率回歸方程方差分析表1

由表5可知，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.981 2，校正系數(shù)Radj2=0.962 4，表明只有3.76%的膳食纖維提取率不能由此模型預(yù)測(cè)得出。模型的變異系數(shù)C.V.=1.60%，表明模型與試驗(yàn)的實(shí)際情況擬合較好，能很好地反映真實(shí)的試驗(yàn)值，因此該模型的可靠性高。

表5 膳食纖維提取率回歸方程方差分析表2

2.2.2 交互作用影響分析

由圖5~圖10可知，因素A和C，B和D，C和D的等高線(xiàn)呈橢圓形，說(shuō)明A和C，B和D，C和D之間的交互作用顯著。因素A和B，B和C的等高線(xiàn)呈圓形，說(shuō)明A和B，B和C之間的交互作用不顯著。從響應(yīng)面曲面圖上可以看出，膳食纖維的提取率存在最大值。

圖5 因素A和B交互影響的等高線(xiàn)和響應(yīng)面

圖6 因素A和C交互影響的等高線(xiàn)和響應(yīng)面

圖10 因素C和D交互影響的等高線(xiàn)和響應(yīng)面

圖7 因素A和D交互影響的等高線(xiàn)和響應(yīng)面

圖8 因素B和C交互影響的等高線(xiàn)和響應(yīng)面

圖9 因素B和D交互影響的等高線(xiàn)和響應(yīng)面

通過(guò)軟件對(duì)回歸模型的分析，得出最佳的提取工藝參數(shù)：α-淀粉酶添加量308.56 U/g，α-淀粉酶作用時(shí)間97.09 min，木瓜蛋白酶添加量202.94 U/g，木瓜蛋白酶作用時(shí)間83.25 min。預(yù)測(cè)的膳食纖維提取率為40.286%。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證模型的可靠性，以模型預(yù)測(cè)結(jié)果的工藝條件進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。為方便試驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)各因素選取α-淀粉酶添加量308 U/g，α-淀粉酶作用時(shí)間97 min，木瓜蛋白酶添加量203 U/g，木瓜蛋白酶作用時(shí)間83 min。經(jīng)過(guò)3次平行試驗(yàn)，在該條件下，馬鈴薯膳食纖維提取率為39.61%，與預(yù)測(cè)值之間差異小于3%。因此該模型對(duì)馬鈴薯膳食纖維提取的預(yù)測(cè)比較準(zhǔn)確，具有使用價(jià)值。

2.3 理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果

由表6可知，試驗(yàn)提取出的膳食纖維其溶脹性達(dá)到7.29 mL/g，持水力達(dá)到6.73 g/g，持油力達(dá)到3.51 g/g。魏春光[11]采用酶法提取出的馬鈴薯膳食纖維，其溶脹性為7.37 mL/g，持水力為7.00 g/g，持油力為1.90 g/g。通過(guò)對(duì)比，表明試驗(yàn)提取出的膳食纖維的理化性質(zhì)較好。

表6 膳食纖維理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

以馬鈴薯為原料，從中提取膳食纖維，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化，得到最佳的提取工藝條件：α-淀粉酶添加量308 U/g，α-淀粉酶作用時(shí)間97 min，木瓜蛋白酶添加量203 U/g，木瓜蛋白酶作用時(shí)間83 min。在此條件下，馬鈴薯膳食纖維提取率為39.61%，與理論得率差異較小；且提取出的膳食纖維，其溶脹性達(dá)到7.29 mL/g，持水力達(dá)到6.73 g/g，持油力達(dá)到3.51 g/g，理化品質(zhì)也較好。此工藝可對(duì)進(jìn)一步完善酶法提取馬鈴薯膳食纖維的工藝提供參考。