于書(shū)娟 劉洪臣

依普黃酮（ipriflavone，IP）作為一種植物類(lèi)雌激素，雖然具有雌激素的作用，但對(duì)子宮內(nèi)膜的刺激作用較?。?］，其較好的骨質(zhì)疏松癥的療效和較小的副作用得到了醫(yī)生和患者的推崇［2］。另外，骨質(zhì)疏松癥和口腔醫(yī)學(xué)有著密切的關(guān)系。有文獻(xiàn)報(bào)道骨質(zhì)疏松癥患者出現(xiàn)水平牙槽骨缺損的風(fēng)險(xiǎn)顯著增高（4.46倍）［3］。骨質(zhì)疏松改變可使大鼠種植體骨界面骨形成蛋白2 含量明顯降低［4］。并且，雌激素受體（estrogen receptor，ER）與骨質(zhì)疏松關(guān)系最為密切［5］；而增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）在細(xì)胞增殖的啟動(dòng)上作用重大，缺乏或低水平的功能性PCNA可能會(huì)促使細(xì)胞凋亡［6，7］，同時(shí)，通過(guò)檢測(cè)去勢(shì)大鼠骨痂標(biāo)本的免疫組化，發(fā)現(xiàn)局部應(yīng)用辛伐他汀可促進(jìn)骨折愈合過(guò)程中細(xì)胞PCNA 的增加［8］。文獻(xiàn)中對(duì)于ER和PCNA共同的研究主要集中在與雌激素密切相關(guān)的子宮內(nèi)膜增生、乳腺癌和甲狀腺癌等中［9］，但是對(duì)于ER和PCNA在同樣與雌激素相關(guān)的骨質(zhì)疏松中的表達(dá)情況未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，對(duì)于依普黃酮作用于骨質(zhì)疏松癥頜骨來(lái)源的成骨細(xì)胞時(shí)，ER和PCNA的表達(dá)情況，也未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。所以，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究依普黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細(xì)胞ER和PCNA表達(dá)的影響，了解依普黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松頜骨成骨細(xì)胞的可能作用機(jī)理。

1.材料和方法

1.1 主要試劑和材料 依普黃酮、DMEM 培養(yǎng)基及胎牛血清、胰蛋白酶和辣根酶過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG分別購(gòu)于美國(guó)的Sigma公司、Gibco 公司、Amresco 公司和Santa 公司，新生牛血清購(gòu)于杭州的四季青公司，總RNA 提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄PCR 試劑盒均購(gòu)于北京的天根公司，蛋白提取試劑盒、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒和PCNA單克隆抗體購(gòu)于武漢的博士德公司，雌二醇放射免疫分析試劑盒購(gòu)于北京的中國(guó)北方生物技術(shù)公司。

1.2 主要儀器設(shè)備 雙能X 線(xiàn)骨密度儀（Lunar，美國(guó)），超凈工作臺(tái)（長(zhǎng)城空氣凈化設(shè)備工程，北京），酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（Bio-Tek，美國(guó)），CO2恒溫孵箱（T-F，美國(guó)），倒置相差顯微鏡（Leica, 德國(guó)), 紫外分光光度計(jì)（BeckmanDU640，美國(guó)）,TDZS-WS 型多管架自動(dòng)平衡高速離心機(jī)（湘儀公司，長(zhǎng)沙），低溫高速離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)），ST-Ⅰ型半干式轉(zhuǎn)移電泳槽（競(jìng)邁生物，大連）。

1.3 動(dòng)物來(lái)源20 只SD 大鼠購(gòu)于中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院，約12 周齡，重約300g，健康未孕雌性。在動(dòng)物中心先行喂養(yǎng)7d，然后進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。

1.4 動(dòng)物模型建立方法 骨質(zhì)疏松大鼠模型的建立在前期實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)有所報(bào)道［10］。實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意（批件號(hào)：2016 科研倫理審第29 號(hào)）。動(dòng)物被隨機(jī)分成兩組：去勢(shì)組（10只）及假手術(shù)組（10 只)，去勢(shì)組的大鼠在麻醉下腹部入口摘除雙側(cè)卵巢；假手術(shù)組的大鼠在麻醉下腹部入口摘除卵巢附近的與卵巢約同等大小的脂肪組織。術(shù)后肌肉注射青霉素預(yù)防傷口感染，發(fā)現(xiàn)兩組大鼠均可正?；顒?dòng)和飲食，傷口未出現(xiàn)明顯感染，無(wú)動(dòng)物死亡情況發(fā)生。術(shù)后正常喂養(yǎng)12 周后，大鼠于麻醉下行腰椎和股骨的骨密度檢測(cè)（雙能X線(xiàn)骨密度儀）。同時(shí)抽取大鼠視網(wǎng)膜動(dòng)脈血，離心10min，取上層血清使用雌二醇放射免疫分析試劑盒測(cè)定血清中雌二醇水平。用于評(píng)估骨質(zhì)疏松大鼠模型是否成功建立。

1.5 成骨細(xì)胞獲取和培養(yǎng) 全麻下處死骨質(zhì)疏松大鼠, 無(wú)菌條件下取出下頜骨，將下頜骨浸泡和沖洗后，去除肌肉和筋膜，拔除牙齒，用酶消法和組織塊法聯(lián)合培養(yǎng)［10］。首先，潔凈操作臺(tái)上，操作者戴無(wú)菌手套用無(wú)菌剪刀將下頜骨逐步剪成小塊，約2mm×2mm 的大小，在PBS液體中浸泡沖洗3次收集骨片。然后用0.125%胰蛋白酶反復(fù)孵育消化骨片6次，每次8min，除首次酶消化的液體丟棄外，后5次消化的液體收集到一起，并于高速離心機(jī)上離心，上層液體丟棄，下層的細(xì)胞加入培養(yǎng)基并且混勻后接種于培養(yǎng)瓶中。經(jīng)過(guò)酶反復(fù)消化后的小骨片，直接加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，在器皿中進(jìn)一步剪成更加細(xì)小的微型骨片，平鋪于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。3d后更換新的培養(yǎng)基，等待全瓶培養(yǎng)出細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.6 成骨細(xì)胞分組干預(yù) 將第三代成骨細(xì)胞接種于6個(gè)6孔板（2×105細(xì)胞/孔）和6個(gè)25cm2的培養(yǎng)瓶中（5×105細(xì)胞/瓶）, 用不含血清的培養(yǎng)基同步化培養(yǎng)細(xì)胞1d，然后將細(xì)胞分成兩組，依普黃酮組和對(duì)照組。依普黃酮組（IP group)：加入含藥物完全培養(yǎng)基（將依普黃酮用完全培養(yǎng)基稀釋?zhuān)@得實(shí)驗(yàn)所需要的依普黃酮濃度10-8M。）；對(duì)照組（control group)：不含藥物完全培養(yǎng)基。6孔板中每個(gè)孔2ml, 培養(yǎng)瓶每瓶5ml。繼續(xù)培養(yǎng)72h。分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）實(shí)驗(yàn)。

1.7 成 骨 細(xì) 胞ERα、ERβ 和PCNA 的RT-PCR 去除培養(yǎng)基后，用PBS 洗滌成骨細(xì)胞3次。首先用Trizol（北京天根生物科技公司，中國(guó)）沖洗細(xì)胞板，獲得RNA。 然后使用Quantscript-RT 試劑盒（北京天根生物科技公司，中國(guó)）直接反轉(zhuǎn)錄1.5μg 的mRNA，用來(lái)制備cDNA，并進(jìn)行PCR。所使用的引物情況如下，ERα（221bp，F(xiàn): TTTGCTCCTAACTTGCTCTTGG，R: GGAGACGTGAGACGAGTCCAT），ERβ（412bp，F(xiàn): GATGGAGGTGCTAATGGTGG，R:GCCCTTGTTACTGATGTGCC），PCNA（135bp，F(xiàn)：TTTGAGGCACGCCTGATCC，R：GGAGACGTGAGACGAGTCCAT），GAPDH（349bp，F(xiàn):GAAATCGTGCGTGACATTA，R:TAGGAGCCAGGGCAGTAA）。每個(gè)25μl 的PCR 反應(yīng)體系包括cDNA模板1.5μl，dNTPs（10mM）0.5μl，10×PCR 緩 沖液2.5μl，β-肌動(dòng) 蛋 白f（25pmol/ul）0.5μl，Taq 酶（2u/ul）0.5μl 和ddH2O。首先在94℃預(yù)變性2min 和初始變性30s，接著分別在63℃退火30s 和在72℃延伸30s，總共30個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后，采用瓊脂糖凝膠對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳，采集圖像，用圖像采集分析軟件（PerkinElmer，Waltham，Massachusetts，USA）對(duì)各條帶積分光光密度（IOD）進(jìn)行分析，目的基因的表達(dá)水平采用目的基因與GADPH基因的IOD值之比來(lái)表示。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 22.0 軟件，數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組之間的比較采用t檢驗(yàn)的方法進(jìn)行分析，如果P<0.05 則認(rèn)為該差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 骨質(zhì)疏松大鼠動(dòng)物模型的建立 術(shù)后12周時(shí)，比較了去勢(shì)組和對(duì)照組大鼠的骨密度和血清雌二醇水平，發(fā)現(xiàn)去勢(shì)組大鼠腰椎的骨密度、股骨的骨密度和血清雌二醇水平在術(shù)后12 周與假手術(shù)組相比顯著降低（P<0.05），見(jiàn)表1，骨質(zhì)疏松大鼠模型成功建立。

表1 大鼠術(shù)后12周時(shí)腰椎骨密度、股骨骨密度和血清雌二醇水平檢測(cè)

2.2 骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細(xì)胞 酶消化后的成骨細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)較快，約4h 后，組織塊培養(yǎng)的成骨細(xì)胞在第3d 時(shí)，才能觀察到少量的成骨細(xì)胞從組織塊中爬出。細(xì)胞一開(kāi)始時(shí)呈現(xiàn)三角形或短梭形，生長(zhǎng)幾天后細(xì)胞的形態(tài)開(kāi)始多樣化，呈現(xiàn)出多邊形、方圓形和多角形等。等待細(xì)胞鋪滿(mǎn)全瓶后傳代，進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)圖1）。

圖1 骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細(xì)胞（×200）

2.3 PCNA、ERα 和ERβ 的mRNA 在依普黃酮干預(yù)骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細(xì)胞后的表達(dá)情況

用含10-8M依普黃酮的培養(yǎng)基干預(yù)培養(yǎng)骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細(xì)胞后，見(jiàn)圖2，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，依普黃酮組PCNA的mRNA表達(dá)量明顯升高（對(duì)照組0.29±0.08，依普黃酮組0.69±0.11，P<0.01），ERα 的mRNA表達(dá)量明顯降低（對(duì)照組0.74±0.09，依普黃酮組0.61±0.06，P<0.05），ERβ的mRNA 的表達(dá)量明顯升高（依普黃酮組1.09±0.09，對(duì)照組0.85±0.12，P<0.05)。并且這種差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 依普黃酮對(duì)PCNA、ERα和ERβ的mRNA表達(dá)的影響（＊P<0.05，＊＊P<0.01）

3.討論

骨質(zhì)疏松作為一種多發(fā)病，雌激素常常作為骨質(zhì)疏松治療藥物應(yīng)用廣泛，但是雌激素對(duì)子宮和乳腺等的副作用較大，使得患者和醫(yī)師對(duì)于它的使用又心有余悸。依普黃酮作為一種植物雌激素，結(jié)構(gòu)與雌激素類(lèi)似，但是它既有類(lèi)似于雌激素的治療骨質(zhì)疏松的作用，而對(duì)某些靶器官如子宮和乳腺等卻沒(méi)有雌激素的副作用，使得在很多國(guó)家得到了廣泛應(yīng)用，所以很有希望成為骨質(zhì)疏松理想的治療藥物。對(duì)于依普黃酮對(duì)骨組織相關(guān)細(xì)胞的研究，陳麗診等曾在誘導(dǎo)的兔破骨細(xì)胞模型研究中發(fā)現(xiàn)，依普黃酮對(duì)破骨細(xì)胞有抑制作用，并且10-8M 的依普黃酮抑制作用最好［11］。在前期的研究中我們也發(fā)現(xiàn)10-8M 的依普黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松頜骨成骨細(xì)胞的增殖分化能力上作用最大［12］。所以在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用了10-8M 的依普黃酮干預(yù)濃度，并且也確實(shí)發(fā)現(xiàn)該濃度的依普黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松頜骨成骨細(xì)胞在ER和PCNA 的表達(dá)上均有一定的影響，從而可能為依普黃酮在口腔領(lǐng)域中的應(yīng)用進(jìn)一步提供了一定的實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。

在研究骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制中，雌激素受體一直受到廣泛的關(guān)注，許多藥物正是通過(guò)直接或間接影響雌激素受體而發(fā)揮作用。雌激素受體有兩種（ERα 和ERβ），ERα 發(fā)現(xiàn)和克隆較早，在20世紀(jì)60年代被發(fā)現(xiàn)并于1986年被克隆［13，14］，ERβ在1996年才被鑒定和克隆［15］。ERα 和ERβ 在C端配體結(jié)合區(qū)和N 端反式激活區(qū)不同，其所起的作用當(dāng)然也會(huì)有所不同。并且有學(xué)者報(bào)道ERα 主要在皮質(zhì)骨中表達(dá)，而ERβ 在松質(zhì)骨中表達(dá)水平較高［16］。與ERα 相比，ERβ 在體外成骨細(xì)胞培養(yǎng)中始終高表達(dá)，提示在雌激素作用機(jī)制中起著重要的作用［17］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，依普黃酮通過(guò)促進(jìn)ERβ 和抑制ERα 對(duì)成骨細(xì)胞產(chǎn)生作用。作為包含牙齒的頜骨，其牙根大部分均包繞在松質(zhì)骨內(nèi)，并且種植后的種植體也大部分位于松質(zhì)骨內(nèi)，所以，如果ERβ 的表達(dá)能增強(qiáng)，就可能會(huì)改善松質(zhì)骨的骨代謝，從而在骨質(zhì)疏松癥頜骨的治療過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。同時(shí)有研究表明ERα 和ERβ 互補(bǔ)，兩者可能為陰陽(yáng)關(guān)系，ERβ 通過(guò)抑制ERa介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，部分替代ERα 的功能［18,19］，從而可能也會(huì)影響和改善皮質(zhì)骨的骨量。另一方面，在子宮內(nèi)，在子宮內(nèi)膜增殖中起主導(dǎo)作用的是ERα，在抗細(xì)胞增殖中起作用的是ERβ，所以如果依普黃酮降低ERα 表達(dá)和增加ERβ 表達(dá)適用于子宮，就會(huì)起到降低子宮內(nèi)膜過(guò)度增殖的作用，但是，這種推測(cè)是否成立，尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還提示依普黃酮可以促進(jìn)PCNA的mRNA 的表達(dá)。而PCNA 是僅在增殖細(xì)胞胞核中合成與表達(dá)的，是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)，其表達(dá)的高低與細(xì)胞增殖密切相關(guān)［20］。在腫瘤的臨床及實(shí)驗(yàn)研究中，PCNA 的檢測(cè)被廣泛應(yīng)用，但是近幾年來(lái)，PCNA 在骨組織或成骨細(xì)胞中的研究也日漸增多。有研究表明PCNA 的激活可以抑制成骨細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)骨折的愈合［21］。并且有學(xué)者通過(guò)檢測(cè)成骨細(xì)胞PCNA的表達(dá)情況，來(lái)作為初步判斷藥物對(duì)骨質(zhì)疏松癥的防治效果或者骨形成情況的參考指標(biāo)［22,23］。也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)PCNA 表達(dá)強(qiáng)弱與骨纖維結(jié)構(gòu)不良病變的復(fù)發(fā)與否密切相關(guān)，它可以作為骨纖預(yù)后估測(cè)的一個(gè)重要參考指標(biāo)［24］。所以本實(shí)驗(yàn)中的PCNA 也許可以作為評(píng)測(cè)骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細(xì)胞的增殖狀態(tài)的一種參考指標(biāo)，并且依普黃酮促進(jìn)其表達(dá)也可以提示依普黃酮可以促進(jìn)骨質(zhì)疏松頜骨成骨細(xì)胞的增殖。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示依普黃酮可以促進(jìn)骨質(zhì)疏松頜骨成骨細(xì)胞的ERβ 和PCNA 的表達(dá)，但是減少ERα 的表達(dá)。當(dāng)然，還有很多的研究需要繼續(xù)深入進(jìn)行，從而探究骨質(zhì)疏松頜骨的分子機(jī)理，找到防治頜骨骨質(zhì)疏松更好的藥物。