孫 琛 朱青青 王佳瓊 張 雪

2000年Gronthos［1］等最先從人牙髓組織中分離培養(yǎng)出牙髓干細(xì)胞，從此關(guān)于牙齒發(fā)育、損傷修復(fù)及再生機(jī)制方面的認(rèn)知程度進(jìn)一步加深，并上升到細(xì)胞層面。在這一背景下，牙髓干細(xì)胞等牙源性干細(xì)胞用于體內(nèi)外組織重建勢(shì)在必行，這是因?yàn)槿搜浪韪杉?xì)胞有自我更新、多向分化等潛能，有助于牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體形成［2,3］。富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）中的生長(zhǎng)因子可誘導(dǎo)多種細(xì)胞增殖、分化［4］。體外研究發(fā)現(xiàn)，PRF 能夠誘導(dǎo)兔半月板細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成［5］。已有研究指出PRF 在牙周和軟組織修復(fù)中起重要作用，但PRF 對(duì)人牙髓干細(xì)胞成骨分化作用報(bào)道少見［6］。本旨在分析PRF 對(duì)牙髓干細(xì)胞成骨分化的作用及機(jī)理，為牙髓干細(xì)胞和PRF 的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、血液來(lái)源 收集本院20歲左右年輕志愿者，因正畸拔除的健康完整恒牙10 顆，并提取牙髓干細(xì)胞，純化擴(kuò)增。志愿者均為無(wú)吸煙、飲酒史的健康男性，各取靜脈血4mL。本研究已經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)審批。

1.1.2 主要藥物與試劑α-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶（武漢普諾賽生物公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒（日本TaKaRa 公司），鼠抗人CD29-PE、CD90-PE、STRO-1-APC單克隆抗體、兔抗人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（Bone morphogenetic protein 2，BMP-2）、Smad1、Smad5、p-Smad1/5、Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related tranion factor 2，RUNX2）多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（日本TaKaRa），BMP 抑制劑LDN-212854、BMP 激活劑山金車內(nèi)酯C（美國(guó)MedChemExpress），堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）試劑盒（上海晶抗生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 牙髓干細(xì)胞培養(yǎng) 用改良組織塊-消化聯(lián)合法培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞，步驟：取出牙髓，PBS 沖洗2 遍，切成小塊，加0.25%胰蛋白酶消化0.5h，離心棄上清，細(xì)胞重懸后繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞匯合率為80%時(shí)傳代。

1.2.2 PRF 的制備 按照Li 等［4］的方法制備PRF。取靜脈血，1500r/min離心10min（離心半徑8cm），分離血漿和血細(xì)胞之間白色PRF 凝塊，排出多余液體，用2片無(wú)菌玻璃片擠壓使PRF 凝塊形成膜狀，滲出液1500r/min 離心10min（離心半徑8cm），獲得無(wú)血細(xì)胞的滲出液，用無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾，儲(chǔ)存于-80℃冰箱中待用。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)牙髓干細(xì)胞表面抗原標(biāo)記物 取傳代培養(yǎng)至第3 代的牙髓干細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，PBS 重懸細(xì)胞，加鼠抗人CD29-PE、CD90-PE、STRO-1-APC，兔抗鼠IgG-APC 為陰性對(duì)照，4℃避光孵育1h，重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4 分組及處理 牙髓干細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、PRF 組、激活劑組和抑制劑組。對(duì)照組牙髓干細(xì)胞用含10%胎牛血清的雙抗α-MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)；PRF 組在10%胎牛血清的雙抗α-MEM 培養(yǎng)基中加入-80 ℃保存的PRF，使PRF 體積分?jǐn)?shù)為50%；激活劑組和抑制劑組在PRF 組培養(yǎng)基基礎(chǔ)上分別加入山金車內(nèi)酯C（終濃度為10μM）和LDN-212854（終濃度為5nM）。

1.2.5 堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）活性檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的牙髓干細(xì)胞，對(duì)照組、PRF 組、激活劑組和抑制劑組加入對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)7d、14d 后，加Triton X-100，4℃過(guò)夜，細(xì)胞完全裂解后加ALP 底物混合液孵育0.5h，0.5mol/L NaOH 終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm處光密度（A）值。

1.2.6 RT-qPCR 檢測(cè)人牙髓干細(xì)胞成骨分化 標(biāo) 志 物 膠 原 蛋 白I（collagen-I，COL-I）、RUNX2、骨鈣素（osteocalcin，OCN）表達(dá) 提取細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書反轉(zhuǎn)為cDNA，進(jìn)行熒光定量PCR，2-△△CT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.2.7 茜素紅染色和半定量檢測(cè) 取對(duì)數(shù)期的牙髓干細(xì)胞，轉(zhuǎn)接到6孔板（1×106個(gè)/mL），細(xì)胞貼壁后，繼續(xù)培養(yǎng)至第14d，固定15min，茜素紅染液染色，倒置顯微鏡下觀察。半定量檢測(cè)：晾干固定好的細(xì)胞，加1mL茜素紅萃取液，在波長(zhǎng)562nm外測(cè)定A值。

1.2.8 Western-Blot 檢 測(cè)BMP2、Smad1、Smad5、p-Smad1/5、RUNX2蛋白相對(duì)表達(dá)水平

取對(duì)數(shù)期的牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)14d，收集細(xì)胞，提取總蛋白，加入SDS-loading buffer，100℃水浴變性，進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2h，一抗孵育過(guò)夜，二抗（1∶4000 稀釋）室溫封閉1h，曝光顯影，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料用（±s）表示，符合正態(tài)分布，方差齊，多樣本計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 人牙髓干細(xì)胞的表型鑒定 CD29、STRO-1、CD90陽(yáng)性細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)，見圖1。

圖1 牙髓干細(xì)胞鑒定

2.2 人牙髓干細(xì)胞ALP活性檢測(cè)PRF組、激活劑組、抑制劑組牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)7d、14d ALP活性高于對(duì)照組（P<0.05）；激活劑組牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)7d、14d ALP活性高于PRF組，抑制劑組牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)7d、14d ALP活性低于PRF組（P<0.05）；抑制劑組牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)7d、14d ALP 活性低于激活劑組（P<0.05）；且隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，對(duì)照組、PRF組、激活劑組、抑制劑組ALP活性也在升高（P<0.05）。見表2。

表2 牙髓干細(xì)胞ALP活性（±s，n=5）

表2 牙髓干細(xì)胞ALP活性（±s，n=5）

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與PRF組比較，bP<0.05；與激活劑組比較，cP<0.05。與培養(yǎng)7d比較，#P<0.05。

組別對(duì)照組PRF組激活劑組抑制劑組F值P值7 d 0.07±0.03 0.23±0.04a0.31±0.04ab0.15±0.03abc14.553<0.001 14 d 0.15±0.03#0.30±0.03a#0.37±0.04ab#0.23±0.03abc#12.214<0.001

2.3 人牙髓干細(xì)胞COL-Ⅰ、RUNX2、OCN mRNA 表達(dá) PRF 組、激活劑組、抑制劑組COL-Ⅰ、RUNX2、OCN mRNA 表達(dá)高于對(duì)照組（P<0.05）；激 活 劑 組COL-Ⅰ、RUNX2、OCN mRNA 表達(dá)高于PRF 組，抑制劑組COL-Ⅰ、RUNX2、OCN mRNA 表 達(dá) 低 于PRF 組（P<0.05）；抑制劑組COL-Ⅰ、RUNX2、OCN mRNA表達(dá)高于激活劑組（P<0.05）。見表3。

表3 人牙髓干細(xì)胞COL-Ⅰ、RUNX2、OCNmRNA表達(dá)水平（±s，n=5）

表3 人牙髓干細(xì)胞COL-Ⅰ、RUNX2、OCNmRNA表達(dá)水平（±s，n=5）

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與PRF組比較，bP<0.05；與激活劑組比較，cP<0.05。

組別對(duì)照組PRF組激活劑組抑制劑組F值P值COL-I 0.37±0.06 0.72±0.07a0.91±0.08ab0.53±0.07abc13.222<0.001 RUNX2 0.28±0.05 0.66±0.06a0.87±0.07ab0.47±0.05abc12.876<0.001 OCN 0.46±0.07 1.02±0.09a1.42±0.09ab0.78±0.08abc14.434<0.001

2.4 各組茜素紅染色半定量分析結(jié)果與紅色礦化結(jié)節(jié)數(shù)目比較 與對(duì)照組比較，PRF組、激活劑組和抑制劑組紅色礦化結(jié)節(jié)數(shù)目增多（P<0.05）；與PRF 組比較，激活劑組紅色礦化結(jié)節(jié)數(shù)目增多（P<0.05），抑制劑組紅色礦化結(jié)節(jié)數(shù)目減少（P<0.05）；與激活劑組比較，抑制劑組紅色礦化結(jié)節(jié)數(shù)目減少（P<0.05）。見圖2。

圖2 各組礦化結(jié)節(jié)形成情況比較（茜素紅×100）

2.5 各組BMP2、Smad1、Smad5、p-Smad1/5、RUNX2 蛋白相對(duì)表達(dá)水平PRF 組、激活劑組和抑制劑組BMP2、p-Smad1/5、RUNX2 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，且抑制劑組

表4 茜素紅染色半定量分析結(jié)果與紅色礦化結(jié)節(jié)數(shù)目（±s，n=5）

表4 茜素紅染色半定量分析結(jié)果與紅色礦化結(jié)節(jié)數(shù)目（±s，n=5）

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與PRF組比較，bP<0.05；與激活劑組比較，cP<0.05。

組別對(duì)照組PRF組激活劑組抑制劑組F值P值A(chǔ)值0.28±0.02 0.66±0.06a1.42±0.09ab0.45±0.03abc389.167<0.001數(shù)目15±6 40±8a112±10ab27±9abc134.970<0.001

表4 BMP2、Smad 1、Smad5、RUNX2蛋白相對(duì)表達(dá)水平（±s，n=5）

表4 BMP2、Smad 1、Smad5、RUNX2蛋白相對(duì)表達(dá)水平（±s，n=5）

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與PRF組比較，bP<0.05；與激活劑組比較，cP<0.05。

組別對(duì)照組PRF組激活劑組抑制劑組F值P值BMP2 0.54±0.07 0.89±0.09a1.18±0.10ab0.39±0.08abc85.760<0.001 Smad1 1.01±0.10 1.02±0.11 1.00±0.10 1.01±0.10 0.158 0.878 Smad5 1.21±0.12 1.20±0.12 1.19±0.12 1.20±0.12 0.316 0.760 p-Smad1/5 0.35±0.06 0.68±0.07a0.91±0.09ab0.22±0.07abc91.473<0.001 RUNX2 0.29±0.04 0.70±0.08a0.90±0.09ab0.13±0.02abc153.899<0.001

圖3 BMP2、Smad1、Smad5、RUNX2蛋白相對(duì)表達(dá)水平

3.討論

Ferrarotti等［7］、Li等［8］、Fuji等［9］研究表明，在一定環(huán)境下，牙髓干細(xì)胞可憑借類似骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的多向分化潛能，分化為骨、肌肉等組織細(xì)胞。PRF富含多種與組織修復(fù)相關(guān)的生長(zhǎng)因子，在牙周和軟組織修復(fù)中也起重要作用，因此研究PRF對(duì)牙髓干細(xì)胞成骨分化的作用對(duì)口腔科學(xué)的發(fā)展至關(guān)重要［10,11］。

CD29、STRO-1、CD90能促進(jìn)干細(xì)胞增殖［12］。本研究中，STRO-1、CD29、CD90陽(yáng)性表達(dá)，表明本研究分離培養(yǎng)的牙髓干細(xì)胞符合其表型。ALP反映成骨細(xì)胞分化程度，并能促進(jìn)骨基質(zhì)礦化形成［13,14］。Matsui等［15］研究表明，干細(xì)胞分化程度與ALP活性成正比。有研究發(fā)現(xiàn)，使用根尖乳頭干細(xì)胞內(nèi)加入PRF后，ALP等成骨標(biāo)志物表達(dá)明顯上調(diào)［16］。本研究中PRF組與對(duì)照組比較，ALP活性明顯升高，礦化結(jié)節(jié)數(shù)目增多，提示PRF可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化。黃奕智等［17］發(fā)現(xiàn)用PRF處理牙周膜成纖維細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞增殖、成骨細(xì)胞分化均有誘導(dǎo)作用。COL-Ⅰ、RUNX2、OCN可謂人牙髓干細(xì)胞的成骨分化標(biāo)志物，本研究中，與對(duì)照組比較，PRF組人牙髓干細(xì)胞COL-Ⅰ、RUNX2、OCN表達(dá)明顯升高，提示PRF可促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞成骨分化。

BMP是調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中扮演重要角色的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1超家族成員。膜表面的BMP配體結(jié)合BMP Ⅰ型和Ⅱ型受體，受體活化后啟動(dòng)Smad依賴型信號(hào)通路，誘導(dǎo)RUNX2 在細(xì)胞核內(nèi)高表達(dá)［18,19］。本研究結(jié)果提示BMPR2 抑制劑可下調(diào)BMPR2-pSmad1/5-RUNX2信號(hào)通路，誘導(dǎo)去分化軟骨肉瘤細(xì)胞凋亡［20］。本研究中PRF組相較于對(duì)照組BMP2、p-Smad1/5、RUNX2 表達(dá)明顯升高，但PRF組BMP2、p-Smad1/5、RUNX2表達(dá)低于激活劑組又高于抑制劑組，提示PRF是通過(guò)激活BMP受體的表達(dá)，促進(jìn)Smad1/5磷酸化，誘導(dǎo)RUNX2表達(dá)發(fā)揮作用，從而促進(jìn)牙髓干細(xì)胞向成骨分化。

綜上所述，PRF 可能通過(guò)激活BMP2/Smads信號(hào)通路促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞成骨分化，為口腔科學(xué)臨床研究奠定基礎(chǔ)。