何敏 王秀璞 李彥 戴志聰 王從彥 杜海 杜道林

摘 要：為了從青藏高原北部（簡(jiǎn)稱(chēng)藏北）退化草原的土壤中分離篩選可以促進(jìn)當(dāng)?shù)氐湫湍敛萆L(zhǎng)的促生菌株，以促進(jìn)藏北植被修復(fù)。該文通過(guò)采用稀釋涂平板的方法，分離耐低溫植物促生菌株，并結(jié)合盆栽試驗(yàn)設(shè)計(jì)，評(píng)估分離細(xì)菌對(duì)當(dāng)?shù)啬敛萆L(zhǎng)的影響。結(jié)果表明：（1）從西藏土壤中成功篩選得到兩株耐低溫細(xì)菌TS22和TS27，經(jīng)16S rRNA基因鑒定分別屬于Brevibacterium sp.和Bacillus mycoides。（2）通過(guò)離體評(píng)估兩株分離菌植物促生屬性的結(jié)果顯示，菌株TS22和TS27均具有產(chǎn)生IAA、SID的能力和ACC-脫氨酶活性，TS22具有較高的ACC-脫氨酶活性（264.69 nmol·α-KB mg-1·h-1），TS27顯示出較強(qiáng)的產(chǎn)IAA[（7.52±3.85）mg·L-1]和SID（92%）的能力。（3）盆栽試驗(yàn)顯示，在10 ℃低溫環(huán)境下，菌株TS22和TS27對(duì)早熟禾和老芒麥生長(zhǎng)的影響因植物和菌種的不同而有所不同;菌株TS22在株高、根長(zhǎng)、地上和地下干重方面顯著促進(jìn)了早熟禾的生長(zhǎng)，且促生能力優(yōu)于TS27。該研究結(jié)果為植物-微生物技術(shù)在藏北高寒地區(qū)植被恢復(fù)中的使用提供了很好的菌種資源和實(shí)踐基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：植物促生菌，低溫環(huán)境，耐低溫菌，植物促生屬性，植物修復(fù)，草原退化

中圖分類(lèi)號(hào)：Q945

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2021）09-1425-08

Abstract：The objective of this study was to screen cold-tolerant plant growth-promoting bacteria （PGPB）for local typical grass in Northern Tibetan Plateau. The serial dilution plating method was used to isolate the PGPB，and pot experiment was designed to evaluate the effect of isolated PGPB on the growth of local grass. The results were as follows：（1）In total，two cold-tolerant PGPB strains named TS22 and TS27 were obtained，which were identified as Brevibacterium sp. and Bacillus mycoides respectively by 16S rRNA gene sequence analysis. （2）Both two strains could produce IAA，SID and ACC-deaminase activity. Strain TS22 showed high ACC-deaminase activity （264.69 nmol·α-KB mg-1·h-1），TS27 displayed higher IAA[（7.52±3.85）mg·L-1] and SID （92%）production ability. （3）Under low temperature （10 ℃），these two isolated PGPB exerted different effects on the growth of Poa annua and Elymus sibericus. Inoculation of strain TS22 significantly improved the growth of Poa annua in plant height，root length，aboveground dry weight，underground dry weight，and showed greater plant growth-promoting activity than strain TS27. This study provides valuable strain resources and experimental basis for application of plant-microbe technique in vegetation restoration in Northern Tibetan Plateau.

Key words：plant growth-promoting bacteria，low-temperature environment，low-temperature-tolerant bacteria，plant growth-promoting properties，plant phytoremediation，grassland degradation

近年來(lái)，藏北高原地區(qū)由于過(guò)度放牧導(dǎo)致草地植被日益退化，已嚴(yán)重威脅當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)生物多樣性、環(huán)境健康質(zhì)量、當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展和人類(lèi)生活質(zhì)量水平。因此，加強(qiáng)草地植被保護(hù)和修復(fù)受到越來(lái)越多的關(guān)注（Wang et al.，2019）。通過(guò)添加化肥、堆肥、高分子材料和腐殖酸等方法，雖然可以有效提高植被修復(fù)效率，但因成本高難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模修復(fù)。

PGPB是一類(lèi)可以直接或間接改善植物健康而促進(jìn)植物生長(zhǎng)的細(xì)菌（Bashan & Holguin，1998），可以通過(guò)固氮、產(chǎn)吲哚-3-乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）、鐵載體（siderophore，SID），產(chǎn)ACC-脫氨酶活性（ACC-deaminase activity，ACC）和溶解不溶性磷酸鹽等方式增加植物營(yíng)養(yǎng)吸收，或者分泌抗生素等物質(zhì)，保護(hù)植物免受病原菌入侵。目前，PGPB已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，如從印度喜馬拉雅山脈的莧菜（Amarantus sp.）根際分離出來(lái)的耐低溫假單胞菌（Pseudomonas sp.），具有產(chǎn)IAA、SID以及溶解磷酸鹽等植物促生（plant growth-promoting，PGP）屬性，使小麥幼苗的發(fā)芽率、株高和根長(zhǎng)分別提高了19.2%、30.0%和22.9%（Mishra et al.，2009）。此外，PGPB在生態(tài)環(huán)境修復(fù)領(lǐng)域還表現(xiàn)出很大的潛力，尤其在特殊極端環(huán)境的植被修復(fù)方面，如PGPB（Azospirillum）與仙人掌在墨西哥等地沙漠治理的作用效果得到前期研究的證實(shí)。接種Azospirillum的仙人掌種子可以在不加肥料的碎石中生長(zhǎng)良好，而未接菌的植株則枯萎甚至死亡（Bashan & de-Bashan，2010a）。采用PGPB可以改善土壤侵蝕區(qū)的植物健康和生長(zhǎng)性能，增強(qiáng)其對(duì)干旱和鹽堿等脅迫的耐受性，有助于脆弱生境原位植被再生，而無(wú)需額外添加化學(xué)肥料，降低了生物修復(fù)的成本。然而，將PGPB應(yīng)用于促進(jìn)西藏高寒草原牧草生長(zhǎng)、修復(fù)當(dāng)?shù)刂脖坏难芯可形匆?jiàn)有報(bào)道。

鑒于藏北高寒脆弱生境條件的特殊性和土著微生物的影響，外源添加PGPB作用效果會(huì)受到限制。本研究從采集的西藏土壤中分離、篩選土著耐低溫PGPB，并在室內(nèi)模擬藏北低溫條件，以藏北高原廣泛分布的兩種本地禾本科牧草早熟禾（Poa annua）和老芒麥（Elymus sibericus）為試驗(yàn)植物，對(duì)分離菌株的植物促生效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

土壤樣品采集于西藏那曲地區(qū)申扎縣（88°37′—88°38′ E 、30°55′—30°56′ N），土壤類(lèi)型以高寒草原土為主。采用5點(diǎn)混合取樣方法，取樣深度0～10 cm，重復(fù)3次。清除采集的土壤樣品中的礫石和植物殘?jiān)?，將土壤樣本放入消毒密封的聚乙烯袋中，帶回試?yàn)室，每份土壤樣品稱(chēng)取50 g，送樣南京卡文思檢測(cè)技術(shù)有限公司（Convinced-Test）進(jìn)行土壤理化性質(zhì)檢測(cè)分析。其余土壤儲(chǔ)存在-20 ℃冰箱中以便后續(xù)進(jìn)行細(xì)菌分離。土壤樣品的營(yíng)養(yǎng)成分如表1所示。

1.2 耐低溫菌的分離鑒定

將0.1 g土樣放入裝有1 mL磷酸鹽緩沖液的離心管中，250 r·min-1、25 ℃振蕩30 min后，對(duì)懸浮液進(jìn)行梯度稀釋。取100 μL稀釋后的懸浮液于Luria-Bertani（LB）平板培養(yǎng)基涂布，置于低溫環(huán)境（4 ℃）下培養(yǎng)，進(jìn)行耐低溫菌分離 （Reasoner & Geldreich，1985）。培養(yǎng)7 d后，挑取單克隆，轉(zhuǎn)移到新鮮LB瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行純化驗(yàn)證。收集分離純化后的菌株，提取總DNA，用細(xì)菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-ACGGTACCTTGTACGACTT-3′）進(jìn)行16S rRNA基因序列PCR擴(kuò)增，所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)驗(yàn)證后送上海生工公司測(cè)序。將測(cè)序所得序列與EzBiocloud數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)。利用MEGA 6.06中的鄰位連接法，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3 PGPB植物促生屬性分析

對(duì)分離菌株的促生特性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。根據(jù)Glickmann & Dessaux （1995）描述的方法，對(duì)分離菌株的產(chǎn)IAA能力進(jìn)行檢測(cè)。將菌株接種在含L-色氨酸的R2A培養(yǎng)基中，孵育72 h后，離心收集無(wú)菌上清液，用比色微板法測(cè)定培養(yǎng)基上清液中IAA在OD530 ?nm波長(zhǎng)處的吸光值，并繪制IAA的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)以定量分析。

按照Penrose & Glick （2002）提出的方法進(jìn)行ACC脫氨酶活性的定量測(cè)定。將細(xì)菌菌體在不含硫酸銨的DF培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h，離心收集沉積的細(xì)菌細(xì)胞;將收集的細(xì)胞重新懸浮在添加3.0 mmol·L-1 ACC的DF培養(yǎng)基中，孵育24 h后，用比色法測(cè)定酶活性。

根據(jù)Cherif-Silini et al. （2016）描述的方法定量測(cè)定SID的產(chǎn)量。在KingB培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后，離心收集500 μL上清液，與500 μL鉻天青S測(cè)定混合溶液。在630 nm波長(zhǎng)處測(cè)定混合物的吸光值。SID的百分比按以下公式計(jì)算：ST-SeST×100%。式中，ST是深藍(lán)的CAS溶液的吸光值（對(duì)照），Se是從藍(lán)色變?yōu)槌壬臉悠返娜芤何庵怠?/p>

為檢測(cè)菌株溶解不溶性磷酸鹽的能力，將分離菌菌懸液分別點(diǎn)接于含有不溶性磷酸鹽Ca3（PO4）2的Pikovskay瓊脂平板的中心，置于28 ℃培養(yǎng)箱（馮瑞章等，2005）。通過(guò)觀(guān)察菌落周?chē)袩o(wú)透明圈和測(cè)量透明圈的大小，來(lái)分析分離菌的溶解不溶性磷酸鹽的能力，并判斷它的有無(wú)及強(qiáng)弱。上述所有指標(biāo)的測(cè)定均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.4 盆栽試驗(yàn)

首先，用75%乙醇溶液浸泡1 min和5% NaClO溶液浸泡5 min對(duì)早熟禾和老芒麥的種子進(jìn)行表面滅菌處理，經(jīng)滅菌水清洗3次后，滅菌種子分別用10 mL濃度為108 cfu·mL-1的菌懸液浸泡2 h，對(duì)照處理用滅菌磷酸鹽緩沖液。然后，將種子播種在裝有180 g滅菌砂的培養(yǎng)瓶中，加入54 mL的0.5倍改良霍格蘭溶液，并在溫室（25 ℃）中培養(yǎng)。根據(jù)西藏土壤礦物鹽組成（表1）改良了Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，配方如下：94.5 g·L-1 Ca（NO3）2·4H2O，50.6 g·L-1 KNO3，8 g·L-1 NH4NO3，0.002 76 g·L-1 KH2PO4，49.3 g·L-1 MgSO4·7H2O，3.73 g·L-1EDTA-2Na，2.78 g·L-1FeSO4·7H2O，0.83 mg·L-1 KI，22.3 mg·L-1 MnSO4，0.25 mg·L-1Na2MoO4，0.025 mg·L-1CoCl2，6.2 mg·L-1 HBO3，8.6 mg·L-1ZnSO4和 0.025 mg·L-1 CuSO4（pH 6.0）。最后，種子萌發(fā)后，將幼苗移至低溫（10 ℃）、光照強(qiáng)度為10 000 lx（光暗=14 h/10 h）的條件下培養(yǎng)（本試驗(yàn)采用的栽培條件是依據(jù)青藏高原6月份的平均溫度、日照強(qiáng)度和日照時(shí)數(shù)而確定）。每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)。

培養(yǎng)30 d后，收獲植株。測(cè)量植株的株高、根長(zhǎng)、地上鮮重、地下鮮重、地上干重和地下干重。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用IBM SPSS Statistics 20統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)記錄的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和雙因素方差分析，以P值的大小評(píng)價(jià)其顯著性。所有圖示均由Origin軟件（2018版）繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐低溫細(xì)菌的分離鑒定

從西藏土壤中，最終成功分離得到TS22和TS27兩株細(xì)菌。將所測(cè)得的分離菌株的16S rRNA基因序列與EzBiocloud數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，確定菌株的分類(lèi)學(xué)地位，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖1），菌株TS22與Brevibacterium frigoritolerans DSM 8801具有最高相似性，為96%，因此初步鑒定其為Brevibacterium屬的新種。菌株TS27與Bacillus mycoides DSM 2048具有最高相似性，為99%，因此該菌株分類(lèi)為B. mycoides。菌株TS22、TS27的16S rRNA基因序列均已提交GenBank，獲得登錄號(hào)分別為MN710445、MN710449。

2.2 分離菌株植物促生屬性檢測(cè)

對(duì)這兩株細(xì)菌的植物促生屬性進(jìn)行了檢測(cè)，包括產(chǎn)IAA、溶解不溶性磷酸鹽、產(chǎn)SID和ACC脫氨酶活性（表2）。表2結(jié)果顯示，菌株TS22具有極高的ACC脫氨酶活性（264.69 nmol·α-KB mg-1·h-1），是菌株TS27的10倍。TS22、TS27均不具有溶磷能力，同時(shí)產(chǎn)IAA能力較低，分別為（3±0.31）、（7.52 ± 3.85）mg·L-1。菌株TS22、TS27具有較高的產(chǎn)SID能力，分別為89.58%±0.08%、92.74%±0.24%。

2.3 分離菌株對(duì)本地牧草生長(zhǎng)的影響

如圖2、圖3所示，接種菌株TS22和TS27對(duì)當(dāng)?shù)啬敛菰缡旌毯屠厦Ⅺ湹纳L(zhǎng)影響各不相同。如圖2所示，與不接種的對(duì)照組相比，接種TS22顯著提高了一年生早熟禾的株高、根長(zhǎng)、地上和地

下部分干重。接種TS27的早熟禾株高、 根長(zhǎng)、 地上和地下部分干重與不接種對(duì)照組相比，分別增加了20.7%、11.1%、89.4%和74.2%，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不具有顯著差異。

如圖3所示，接種TS22和TS27沒(méi)有明顯的促進(jìn)作用，甚至有輕微抑制作用。接種TS22使老芒麥地上和地下干重分別降低了1.4%和5.4%。而接種TS27的處理顯著縮短了22%的根長(zhǎng)。

2.4 分離菌株與植物生長(zhǎng)屬性的相關(guān)性分析

雙因素方差分析結(jié)果表明，植物種類(lèi)僅對(duì)地下鮮重、干重有顯著影響，細(xì)菌種類(lèi)對(duì)所有植物生長(zhǎng)指標(biāo)都有影響;植物和細(xì)菌交互協(xié)同作用，對(duì)植物生物量相關(guān)的指標(biāo)有影響（表3）。

3 討論與結(jié)論

在利用PGPB進(jìn)行退化土壤植被再生修復(fù)的過(guò)程中，微生物菌劑的選擇具有決定性作用。對(duì)于條件苛刻的特殊生境，接種外源PGPB菌劑到特殊生境會(huì)受到來(lái)自生存環(huán)境巨大變化和本土微生物競(jìng)爭(zhēng)的雙重挑戰(zhàn)，從而限制了外源PGPB接種劑的存活及功能活性。選擇土著PGPB作為接種劑，可以更好適應(yīng)本土環(huán)境，有助于發(fā)揮預(yù)期效果（Schlaeppi et al.，2016）。

本研究針對(duì)藏北地區(qū)獨(dú)特的地理環(huán)境和寒冷干燥的氣候特征，從藏北土壤中分離到兩株耐低溫植物促生菌，Brevibacterium sp. TS22和Bacillus mycoides TS27。許多Bacillus屬的細(xì)菌被發(fā)現(xiàn)具有植物促生功能（Santoyo et al.，2012），但關(guān)于Brevibacterium屬菌的植物促生功能鮮有報(bào)道。Wang et al. （2016）從青藏高原細(xì)葉嵩草中分離篩選到Brevibacterium屬的內(nèi)生菌，該菌被檢測(cè)發(fā)現(xiàn)具有多種植物促生特性，但該報(bào)道尚未對(duì)該分離菌進(jìn)行進(jìn)一步功能驗(yàn)證。 Meena et al. （2017）從庫(kù)拉索蘆薈根際中成功分離到一株具有多種植物促生屬性的Brevibacterium frigoritolerans SMA23，在10 ℃低溫下對(duì)小麥生長(zhǎng)有積極影響。通過(guò)對(duì)分離菌產(chǎn)IAA、SID、ACC-脫氨酶等植物促生性能的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，兩株分離菌株均可以產(chǎn)IAA、SID和ACC-脫氨酶，并且TS22具有高效ACC-脫氨酶活性（264.69 nmol·α-KB mg-1·h-1），TS27具有更高的產(chǎn)IAA[（7.52±3.85）mg·L-1]和SID（92%）能力。 IAA是一種常見(jiàn)的植物促生長(zhǎng)激素，Gonita-Mishra et al. （2017）報(bào)道了38株分離菌，其中89.47%的菌株能產(chǎn)生顯著的IAA（4.7～77.41 mg·L-1）。作為一種高效的植物生長(zhǎng)激素，較高的IAA產(chǎn)量能夠引起幼苗的形態(tài)和生理變化（Masciarelli et al.，2013）。SID在植物根系鐵的生物有效性中起著重要作用（Sorty & Shaikh，2015）。其與植物根際的鐵具有很高的親和力，能結(jié)合根際環(huán)境中大部分的有效鐵，與此同時(shí)限制了根部病原微生物對(duì)有效鐵的利用，起到了抑制病原菌增殖的效果（O′Gara，1992）。細(xì)菌產(chǎn)ACC-脫氨酶降低植物乙烯水平，緩解各類(lèi)脅迫，是這些細(xì)菌發(fā)揮作用的關(guān)鍵組成成分，包括保護(hù)植物免受洪水、干旱、鹽分、花卉枯萎、金屬、有機(jī)污染物以及細(xì)菌和真菌病原體的侵襲（Glick，2014）。本研究中分離到耐低溫菌株TS22和TS27不但能適應(yīng)青藏高原寒冷高海拔環(huán)境，且具有不同程度的植物促生潛力，為后續(xù)藏北高原植被再生提供了寶貴的菌種資源。

當(dāng)把TS22和TS27接種到藏北本地牧草早熟禾和老芒麥植物根際時(shí)，菌株TS22對(duì)早熟禾植株表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)促進(jìn)作用，而對(duì)老芒麥的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯促進(jìn)效應(yīng);菌株TS27則對(duì)兩種禾草的促生作用均不明顯。已有研究表明，并非所有具有PGP特性的細(xì)菌都能對(duì)植物的生長(zhǎng)產(chǎn)生積極影響，菌-植互作的環(huán)境與寄主植物及菌劑的種類(lèi)均會(huì)影響植物促生的效果（de-Bashan et al.，2012）。同時(shí)，PGPB促進(jìn)植物生長(zhǎng)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及不同促生屬性間的協(xié)同作用。Bashan & de-Bashan（2010b）通過(guò)對(duì)兼有多種植物促生特性的PGPB菌株Azospirillum brasilense的作用機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，A. brasilense的作用機(jī)制并非單一，在一定環(huán)境條件下這些促生機(jī)制同時(shí)或相繼運(yùn)行。本研究的盆栽結(jié)果表明植物生長(zhǎng)效果因植物和細(xì)菌種類(lèi)的不同而有差異。菌株TS22所表現(xiàn)的多種促生屬性間的協(xié)同模式可能更適合早熟禾植株的生長(zhǎng)。由此可見(jiàn)，對(duì)于不同植株選擇恰當(dāng)?shù)腜GPB很重要，應(yīng)根據(jù)接種試驗(yàn)效果進(jìn)行有目的篩選，有關(guān)PGPB-宿主植物相互作用的機(jī)制研究有待于進(jìn)一步挖掘。

綜上所述，本研究在藏北高原特殊環(huán)境條件下分離篩選到可以有效促進(jìn)當(dāng)?shù)啬敛萆L(zhǎng)的低溫植物促生菌，為后續(xù)植物-微生物技術(shù)在藏北高寒地區(qū)的植被修復(fù)應(yīng)用提供了寶貴的菌種資源和應(yīng)用基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 蔣巧媛）