陳桂平 張曉東

摘 要：土壤鹽漬化是當(dāng)今農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的重要危害之一，它嚴重影響當(dāng)?shù)剞r(nóng)作物的生長、發(fā)育及產(chǎn)量的提高。為了提高鹽堿地的利用效率，該文以蒲公英耐鹽突變體 ‘濱蒲1號 及其親本葉片為材料進行丙二醛（MDA）含量等8種生理指標的測定，同時利用cDNA-RAPD技術(shù)對蒲公英耐鹽突變體及其親本根脅迫0、12、24 h的差異表達基因進行分析。結(jié)果表明：（1）突變體 ‘濱蒲1號 葉片中脯氨酸含量、葉綠素含量、可溶性蛋白含量、CAT活性、POD活性、SOD活性在不同脅迫時間點均大體高于親本;MDA含量、相對電導(dǎo)率低于親本。（2）以篩選出的 10條 RAPD 引物進行cDNA-RAPD分析，共擴增出 22 條清晰的條帶，差異條帶10條，多態(tài)性為45.4%。（3）擴增產(chǎn)物片段大小在150 ～1 000 bp之間，主要為鹽抑制基因片段，推測蒲公英耐鹽突變體 ‘濱蒲1號 的耐鹽性既與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸及多種抗氧化酶上升引起的保護作用有關(guān)，也與根中一些與耐鹽相關(guān)的基因表達變化有關(guān)。該研究為進一步克隆蒲公英耐鹽基因并利用基因工程手段培育耐鹽優(yōu)質(zhì)的蒲公英新品系奠定一定的理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：蒲公英，耐鹽突變體，生理指標，cDNA-RAPD，差異表達基因

中圖分類號：Q943

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2021）09-1417-08

Abstract：Soil salinization is one of main hazards in agricultural production，seriously declining growth，development and yield of local crops. In order to improve utilization efficiency of saline land，salt-tolerant mutant ‘BINPU 1. of Taraxacum mongolicum and its parents were chosen as experimental materials，and eight physiological parameters such as malondialdehyde （MDA）contents were determined，as well as analysis of differentially expressed genes in the root under saline treatments of 0，12 and 24 h through cDNA-RAPD technique. The results were as follows：（1）Except for MDA content and relative conductivity，contents of proline，chlorophyll and soluble protein，and activities of CAT，POD and SOD in leaves of the mutant ‘BINPU 1. under different saline treatments were all higher than those of the parents in general. （2）Totally 22 clear bands were amplified through cDNA-RAPD technique using 10 screened RAPD primers，of which，10 different bands were found and the polymorphism was 45.4%. （3）Fragment size of amplification product ranged from 150 to 1 000 bp，mainly consisting of fragments of salt suppressor genes，indicating that the ability of salt-tolerant mutant ‘BINPU 1. T. mongolicum was related to the protective effects caused by the increase of osmotic regulating substance such as proline and various of antioxidant enzymes activities，as well as some differentially expressed genes in roots. This study provides a theoretical support for further cloning salt-tolerant genes in T. mongolicum and breeding new salt-tolerant T. mongolicum cultivars through genetic engineering.

Key words：Taraxacum mongolicum，salt-tolerant mutant，physiological indexes，cDNA-RAPD，differentially expressed gene

土壤鹽漬化是植物的主要非生物脅迫形式，嚴重阻礙著農(nóng)業(yè)的發(fā)展（張榮梅和馬彥軍，2017）。近年來隨著生態(tài)環(huán)境的惡化和盲目過量的施用化肥，土壤鹽漬化程度在進一步加大，篩選培育耐鹽植物是開發(fā)利用鹽堿地的一種有效方法。近年來植物體細胞耐鹽突變體篩選研究已經(jīng)成為抗鹽植物育種學(xué)術(shù)研究的熱點問題。前人已經(jīng)在水稻、玉米、狼尾蕨等多種植物上獲得耐鹽細胞系的再生植株并對其耐鹽機理進行了研究（馬進等，2009;梁麗建等，2015）。

蒲公英 （Taraxacum mongolicum）別名蒲公草、黃花地丁、婆婆丁、黃花三七，是菊科（Asteraceae）蒲公英（Taraxacum F. H. Wigg）屬多年生草本植物。蒲公英性寒味苦，具有清熱解毒等功效，蒲公英的化學(xué)成分復(fù)雜，其主要活性成分是蒲公英甾醇，此外還含有綠原酸、總黃酮、咖啡酸、生物堿、多糖等，其藥用價值很高，對許多致病菌均有一定的殺菌作用（沈鳳閣和袁昌齊，2011）。近幾年，人們充分認識到蒲公英的營養(yǎng)價值、醫(yī)療價值和經(jīng)濟價值，開始進行蒲公英的大規(guī)模栽培。蒲公英屬鹽生植物，適應(yīng)性強，耐寒、耐熱、耐酸堿、耐瘠薄性均較強。目前有關(guān)蒲公英耐鹽性研究報道不多。例如，張曉輝和林辰壹（2012）研究發(fā)現(xiàn)蒲公英對單鹽及混合鹽堿脅迫均表現(xiàn)出一定的耐受性，適當(dāng)濃度鹽堿溶液脅迫有助于促進蒲公英萌發(fā)出苗，堿性鹽對蒲公英出苗的脅迫作用大于中性鹽。馮昕等（2013）以碳酸氫鈉溶液為脅迫溶液，研究蒲公英葉片中蛋白表達的動態(tài)變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)了12個耐鹽性相關(guān)的蛋白質(zhì)。劉雅輝等（2017）采用盆栽試驗，分析不同鹽分質(zhì)量分數(shù)的濱海原土對蒲公英幼苗的生長發(fā)育及體內(nèi)不同部位Na+和K+質(zhì)量分數(shù)及K+/Na+的影響，確定了蒲公英苗期耐鹽鑒定指標為葉長，耐鹽閾值為0.42%。河北省農(nóng)林科學(xué)院濱海農(nóng)業(yè)研究所通過無性系繁殖結(jié)合耐鹽性篩選獲得了耐鹽突變體‘濱蒲1號，初步觀察到該突變體與對照相比發(fā)生了表型的變化：葉片變寬變大、生物量增大、有效成分增加、耐鹽性和抗病性增強（劉艷芬等，2018;王秀萍和魯雪林，2019）。植物生理指標的變化與品種耐鹽性之間有較高的相關(guān)性，因此研究鹽脅迫下蒲公英耐鹽突變體‘濱蒲1號的生理指標變化，對了解其耐鹽機理非常重要。

cDNA-RAPD （cDNA-Random Amplified Polymorphic DNA）技術(shù)是以cDNA為模板進行的RAPD擴增方法，可用于進行基因差異表達的分析。該方法簡便、費用低、省時省力（李鵬等，2007）。前人利用該技術(shù)在不同物種中進行了差異基因的分析，并分離和克隆了多個有價值的基因 （Mizumoto et al.，2009;Pagrivam et al.，2011）。本研究通過從生理生化和分子水平探討耐鹽突變體‘濱蒲1號的耐鹽機理，為進一步克隆蒲公英耐鹽基因并利用基因工程手段培育耐鹽優(yōu)質(zhì)的蒲公英新品系奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蒲公英突變體 ‘濱蒲1號及其親本由河北省農(nóng)林科學(xué)院濱海農(nóng)業(yè)研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 蒲公英耐鹽突變體及其親本材料的培養(yǎng)及鹽脅迫處理

1.2.1.1 親本材料的培養(yǎng) 將蒲公英種子水培，每天光照16 h，待種子生根發(fā)芽后，將幼苗移至營養(yǎng)土（營養(yǎng)土∶蛭石=3∶1）中。挑選土培兩個月且生長狀況良好的蒲公英耐鹽突變體及其親本進行水培兩天后進行鹽脅迫處理。

1.2.1.2 NaCl最佳脅迫濃度的篩選 結(jié)合Amel & Zoheir（2016）的方法初步選取NaCl濃度為120、170、220 mmol·L-1，對蒲公英植株進行72 h的脅迫，觀察其生長狀況，選取最佳鹽濃度。

1.2.1.3 鹽脅迫處理 用篩選出的最佳鹽脅迫濃度的鹽溶液對蒲公英進行0、2、12、24、48、72 h處理，按照不同脅迫時間取樣（生理指標測定：0、2、12、24、48、72 h;根RNA提?。?、12、24 h）。樣品迅速放入液氮中以便后續(xù)實驗。

1.2.2 生理指標測定方法 丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測定，葉綠素含量采用無水乙醇提取法結(jié)合分光光度計測定，相對電導(dǎo)率采用DDS-11A型電導(dǎo)儀測定，脯氨酸含量采用酸性茚三酮-甲苯法測定，可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性、過氧化物酶（POD）活性均采用試劑盒測定（購自南京建成生物工程公司）。

1.2.3 RNA提取與cDNA合成 蒲公英根總RNA的提取采用TRIZOL試劑法，用DNaseⅠ酶 （RNasefree）消化和氯仿抽提，所提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測可見條帶完整，無降解現(xiàn)象。OD 260/280值均在1.9～2.0之間，表明RNA無污染，可用做cDNA反轉(zhuǎn)錄模板。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒[FastQuant RT Kit （With gDNase）KR106，購自天根科技生化有限公司（北京）]。

1.2.4 RAPD法擴增cDNA

1.2.4.1 引物篩選 選取兩個質(zhì)量較好的 RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，稀釋5倍后作為模板。對42條引物進行篩選，42條引物選自文獻（李紅等，2018）及北京鼎國生物公布的 520 條 RAPD引物，擴增產(chǎn)物在2% 瓊脂糖凝膠中電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)成像拍照。最終從42條隨機引物中篩選出10條重復(fù)性高且清晰的引物作為PCR擴增的最適引物（表1）。

1.2.4.2 PCR擴增及電泳檢測 RAPD反應(yīng)體系20 μL：cDNA（反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物原液稀釋5倍）2 μL，2 x Taq PCR MasterMix 10 μL，RAPD隨機引物（10 μmol·L-1）1.6 μL，RNase Free dH2O 6.4 μL。擴增反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min; 95 ℃變性30 s，復(fù)性30 s （溫度參考表1），72 ℃延伸1min，共35個循環(huán); 最后72 ℃延伸7 min。擴增產(chǎn)物在2.0%的瓊脂糖凝膠上電泳分離，電壓120 V，在凝膠成像系統(tǒng)成像，拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳鹽脅迫濃度篩選

將蒲公英幼苗在120、170、220 mmol·L-1 3個濃度梯度NaCl溶液中進行脅迫72 h，以在水中生長的幼苗作為對照，觀察蒲公英幼苗變化情況。結(jié)果如圖1：A所示，對照中3盒蒲公英幼苗長勢相近，生長均較旺盛。脅迫72 h之后，120 mmol·L-1 NaCl溶液對蒲公英幼苗影響不明顯，170 mmol·L-1 NaCl溶液對蒲公英幼苗有影響但不致死，220 mmol·L-1 NaCl溶液使蒲公英幼苗部分致死（圖1：B）。選取對蒲公英幼苗有影響且不致死濃度為最佳脅迫濃度，將最終脅迫濃度定為170 mmol·L-1。

2.2 蒲公英耐鹽突變體‘濱蒲1號及其親本在鹽脅迫下生理指標的分析

2.2.1 脯氨酸、葉綠素、MDA含量和相對電導(dǎo)率的分析 蒲公英耐鹽突變體‘濱蒲1號和親本經(jīng)170 mmol·L-1 NaCl脅迫0～72 h各時間點所測得的脯氨酸含量結(jié)果如圖2：A所示，兩種樣品的脯氨酸含量整體均呈上升趨勢，突變體‘濱蒲1號脯氨酸含量在0 h顯著高于親本，鹽脅迫2 h后極顯著高于親本，隨著脅迫時間延長至12 h時有所下降，之后又開始上升，脅迫72 h時‘濱蒲1號中脯氨酸含量顯著高于親本。兩種樣品的葉綠素含量整體上均呈下降趨勢，‘濱蒲1號的葉綠素含量在整體上高于親本，脅迫2 h后‘濱蒲1號葉綠素含量顯著低于親本，脅迫48 h后‘濱蒲1號葉綠素含量極顯著高于親本，脅迫72 h后‘濱蒲1號顯著高于親本（圖2：B）。兩種樣品的MDA含量均隨脅迫時間延長而上升，上升的趨勢為先快后慢，并且在整個鹽脅迫的過程中親本的MDA含量都高于耐鹽突變體‘濱蒲1號（圖2：C）。兩種樣品相對電導(dǎo)率均呈波動上升趨勢，并且在整個鹽脅迫的過程中親本的相對電導(dǎo)率都高于耐鹽突變體‘濱蒲1號（圖2：D）。

2.2.2 鹽脅迫下可溶性蛋白含量以及CAT、SOD、POD活性分析 蒲公英突變體‘濱蒲1號及其親本在170 mmol·L-1 NaCl脅迫下0～72 h測得的可溶性蛋白含量結(jié)果如圖3：A所示，突變體‘濱蒲1號呈波動下降趨勢，親本可溶性蛋白含量變化趨勢呈先下降后上升再下降趨勢，‘濱蒲1號可溶性蛋白含量在0、2、24、48和72 h時極顯著高于親本。突變體‘濱蒲1號和親本CAT活性都是在脅迫2 h后上升到最高點之后逐漸下降，‘濱蒲1號CAT活性在鹽脅迫之后（除脅迫2 h外）顯著高于親本，其他時間點均極顯著高于親本（圖3：B）。突變體‘濱蒲1號和親本SOD活性幾乎呈同步波動上升趨勢，但在48 h時達到最高點之后又逐漸下降，‘濱蒲1號SOD活性在鹽脅迫0、2、24、48 h時極顯著高于親本，在脅迫12和72 h時顯著高于親本（圖3：C）。鹽脅迫下‘濱蒲1號及親本POD活性均呈波動上升趨勢，在2、12 h鹽脅迫過程中，‘濱蒲1號POD活性顯著高于親本，在0、24、48、72 h鹽脅迫過程中，‘濱蒲1號POD活性極顯著高于親本（圖3：D）。

2.3 蒲公英耐鹽突變體‘濱蒲1號及其親本在鹽脅迫下根中cDNA-RAPD分析

以篩選出的 10條 RAPD 引物對突變體‘濱蒲1號及其親本鹽脅迫0、12、24 h 的根中cDNA進行RAPD擴增分析，擴增產(chǎn)物片段的大小在150～1 000 bp之間，共擴增出 22 條清晰的條帶，多態(tài)性條帶有10條，其中2條條帶為鹽誘導(dǎo)相關(guān)基因片段，8條為鹽抑制相關(guān)基因片段。多態(tài)性為45.4%。如引物U11所擴增的400 bp左右的條帶在鹽脅迫0 h時親本及‘濱蒲1號表達較強，可見較亮條帶，在鹽脅迫12 h時二者均不表達，而在鹽脅迫24 h時二者均表達，但條帶較暗、表達較弱，推測為鹽抑制基因片段（圖4：A）。

引物I09所擴增的900～1 000 bp的條帶隨鹽脅迫時間延長表達逐漸減弱，可能為鹽抑制基因片段，而且在突變體在鹽脅迫12 h時表達量受抑制程度大于親本;引物U13所擴增的在600～700 bp之間的條帶隨鹽脅迫時間增加表達逐漸減弱，并且突變體‘濱蒲1號的表達總是強于親本，而且突變體在鹽脅迫12 h時表達量受抑制程度大于親本;引物U19擴增的4條為200～300 bp、600 bp左右、600～700 bp以及1 500 bp左右的條帶在鹽脅迫各時間段中均有表達，其中1 500 bp左右的條帶隨著鹽脅迫時間的延長逐漸減弱，可能為鹽抑制基因片段，其他3個條帶均穩(wěn)定表達，不受脅迫時間影響（圖4：B）。

3 討論與結(jié)論

土壤鹽漬化是限制植物生長的重要因素之一。

研究鹽脅迫調(diào)控機制和選育耐鹽植物有利于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和增產(chǎn)。植物受到鹽脅迫后多個生理指標會發(fā)生改變。脯氨酸會迅速增加來調(diào)節(jié)細胞的滲透能力、維持膨壓、保護酶和膜系統(tǒng)免受毒害，已有資料表明脯氨酸可以作為植物對水分脅迫或鹽脅迫的一種耐性生理指標（Jaleel et al.，2007）。本研究中蒲公英耐鹽突變體‘濱蒲1號脯氨酸含量在脅迫中期比親本含量有所下降，但隨著脅迫時間的延長又逐漸升高，表明鹽脅迫對突變體造成的損傷更低，通過增加脯氨酸含量來調(diào)節(jié)滲透平衡，對植株在滲透脅迫下的生長起到保護作用。葉綠體是對鹽脅迫最敏感的細胞器之一，Rao et al.（1981）發(fā)現(xiàn)鹽脅迫會破壞植物葉片內(nèi)的葉綠體結(jié)構(gòu)，抑制葉綠素的合成或者促進葉綠素的分解，使葉綠素含量下降，引起植株光合能力降低。梁麗建等（2015）研究表明隨鹽濃度的增加和脅迫時間的延長狼尾蕨耐鹽突變體NY-7的葉綠素含量下降幅度低于親本。本研究中蒲公英耐鹽突變體‘濱蒲1號在鹽脅迫不同時間點葉綠素下降幅度均低于親本，與梁麗建等（2015）的研究結(jié)果一致，表明其對鹽分的緩沖作用較強，能更好地適應(yīng)NaCl誘發(fā)的毒害環(huán)境，耐鹽性高于親本。植物受低溫、鹽堿等逆境傷害往往發(fā)生膜脂過氧化作用，MDA是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物，其含量的變化常常作為脂質(zhì)過氧化的生物化學(xué)指標，能夠反映膜結(jié)構(gòu)的損傷程度及脅迫條件下的耐性。同時逆境的傷害引起質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)改變、透性增大、相對電導(dǎo)率增加。因此，用電導(dǎo)率法測定質(zhì)膜的透性變化情況可作為鑒定植物抗逆性的指標（劉文竹等，2019;王旭明等，2019）。本研究中突變體‘濱蒲1號在鹽脅迫不同時間所測定的MDA含量和相對電導(dǎo)率上升幅度均小于親本，說明突變體‘濱蒲1號能夠通過緩解質(zhì)膜受損程度來提高其耐鹽性。

周嬋等（2009）研究認為植物的可溶性蛋白作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，能提高細胞的保水能力，對細胞的生物膜起到保護作用，含量一般也會增加。植物受到鹽脅迫后會產(chǎn)生大量的活性氧自由基從而對細胞膜產(chǎn)生傷害，而清除這些活性氧自由基的抗氧化酶活力也會發(fā)生變化從而維持細胞膜的穩(wěn)定性。雖然隨著鹽濃度的增加，植物體內(nèi)保護酶活性呈現(xiàn)升高的趨勢，但當(dāng)鹽濃度超過一定的范圍時，植物體內(nèi)積累的活性氧超出了保護酶清除范圍，保護酶活性會隨之下降（高彩婷等，2017;白麗麗等，2019）。本研究中蒲公英耐鹽突變體‘濱蒲1號受鹽脅迫后可溶性蛋白含量、CAT活性、POD活性、SOD活性整體均高于親本，而且CAT活性、SOD活性均隨著脅迫時間的延長有下降的趨勢，這與劉燕等（2019）認為草地早熟禾幼苗‘解放者、‘午夜2號和‘搶手股通過啟動抗氧化酶系統(tǒng)來抵御鹽脅迫的研究結(jié)論一致，說明蒲公英耐鹽突變體‘濱蒲1號具有比親本更強的酶促防御系統(tǒng)，能有效地清除活性氧，以確保植物體內(nèi)較低的膜脂過氧化程度?？傊?，通過測定蒲公英耐鹽突變體‘濱蒲1號鹽脅迫下8種生理指標的變化，推測‘濱蒲1號耐鹽性提高可能與提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸含量、葉綠素含量及多種抗氧化酶上升引起的保護作用和降低MDA含量和相對電導(dǎo)率等傷害作用有關(guān)，說明它能通過增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，降低活性氧自由基來緩解脅迫帶來的傷害，提高耐鹽性。突變體‘濱蒲1號不但耐鹽性強，而且株型高大，長勢旺盛，綠原酸等有效成分含量高，現(xiàn)已在唐山濱海地區(qū)中度以下鹽堿地推廣種植，具增強免疫力的蒲公英功能性飲料和功能性飼料正在開發(fā)之中。后續(xù)可在全國其他鹽堿地區(qū)推廣種植，為高效利用鹽土資源，調(diào)整濱海鹽堿區(qū)農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)和農(nóng)民增收探索新途徑。

cDNA-RAPD分析法作為一種操作簡便、成本低廉的基因表達差異分析技術(shù)，近年來國內(nèi)已有多人利用該技術(shù)進行了基因差異表達分析。例如，郭磊等（2011）用10條引物分析藤稔葡萄夏芽不同發(fā)育時期相關(guān)基因的差異表達;黃守程等（2013）用9條引物初步探究了耐鋁大豆的基因表達差異情況;李新梅（2006）利用 cDNA-RAPD技術(shù)建立了一套較為穩(wěn)定的桑樹基因差異表達的檢測體系，并對桑樹鹽脅迫及甜菜堿處理下3種不同材料的基因差異表達進行了分析。本項目采用cDNA-RAPD技術(shù)對鹽脅迫處理0、12、24 h的突變體‘濱蒲1號及其親本根中與鹽脅迫相關(guān)的差異表達基因進行分析，篩選出的10條引物cDNA-RAPD 擴增結(jié)果良好，得到了10條差異表達基因條帶，其中2條為鹽誘導(dǎo)基因片段，8條為鹽抑制基因片段。由于該方法存在一定的假陽性，這些差異基因片段還需通過Northern 雜交或逆轉(zhuǎn)錄定量 PCR （qRT-PCR）進行重復(fù)證實。進一步克隆這些差異基因的全長并驗證其在耐鹽性中的功能，為挖掘蒲公英抗性基因并利用基因工程技術(shù)培育耐鹽植物提供一定的依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）