謝 濤，張 婷，范茗華，羅曉婷

（1.贛南醫(yī)學院2019級碩士研究生；2.贛南醫(yī)學院2020級碩士研究生；3.贛南醫(yī)學院2017級臨床醫(yī)學專業(yè)本科生；4.贛南醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，江西 贛州 341000）

糖尿?。―iabetes mellitus，DM）是全球最普遍的代謝疾病之一，國際糖尿病聯(lián)盟（International Diabetes Federation，IDF）數(shù)據(jù)顯示，至2019年有4.63億人（占人口的9.3%）患有DM，預計這一數(shù)字到2045年將達到7億（占人口的10.9%），2019年，20～79歲DM患者人數(shù)最多的國家是中國、印度和美國，預計到2030年仍將如此［1］。2019年，中國DM患病人數(shù)已達1.164億，預計到2045年將達到1.472億。近年來，有幾種方法一直是診斷DM的黃金標準，包括空腹血糖（Fasting blood glucose，F(xiàn)PG）水平、餐后2小時血糖（2hPG）水平和糖化血紅蛋白（Glycosylated hemoglobin，HbA1c）水平。2010年，美國糖尿病協(xié)會（American diabetes association，ADA）增加了HbA1c作為DM和DM前期的診斷標準［2］。然而，由于個體差異、檢測平臺和檢測工具的不同，數(shù)據(jù)存在一定比例的高偏差和低再現(xiàn)性。2型糖尿病是最常見的DM類型，約占全球DM的90%［3］。迄今為止，T2DM的病因仍不清楚，發(fā)病率和患病率仍在急劇上升。T2DM在全球的形勢非常嚴峻，如果能夠?qū)μ悄虿∏捌冢≒re-DM）人群實施預防性干預，改善對這些個體的護理，T2DM的發(fā)病和發(fā)展將會大大推遲，從而延遲T2DM的發(fā)生或降低其嚴重性［4］。因此，篩選和鑒定對T2DM診斷和預后具有高度特異性和敏感性的新型生物標志物是當前臨床研究的重點和未來的挑戰(zhàn)［5］。

1 循環(huán)miRNA結(jié)構(gòu)、組成與功能

miRNA是由大約22個核苷酸組成的單鏈核糖核酸，來源于內(nèi)源性發(fā)夾狀轉(zhuǎn)錄物［6］，能夠通過降解或翻譯抑制特定目標RNA來抑制基因表達［7-8］。他們在細胞內(nèi)首先形成長度為70～90個堿基的單鏈RNA前體（Pre-miRNA）［9］，再經(jīng)一種稱為Dicer酶的RNA酶進行剪切后形成。這些成熟的miRNA與其他蛋白質(zhì)一起組成RNA誘導的沉默復合體（RNAinduced silencing complex，RISC）［10］，通 過 與 其 靶mRNA分子3′端非翻譯區(qū)（3′UTR）互補匹配，再以目前尚不清楚的機制抑制該mRNA分子的翻譯［11］。在臨床上，一個理想的生物標志物應該通過微創(chuàng)采樣能夠容易被獲得，血液、尿液或唾液檢測成為很好的選擇來源［12］。在試圖鑒定miRNA是T2DM新型生物標志物的過程中，miRNA表達譜通常在培養(yǎng)的細胞、血液和實體組織樣品中進行［13］。2008年，LAWRIE等［14］在血液中檢測到循環(huán)miRNA，血液攜帶大量的生物分子，包括營養(yǎng)物質(zhì)、激素等分子，在這些分子中，循環(huán)miRNA被認為存在于血液循環(huán)中，并且是有用的檢測指標，不僅在血細胞中可檢測到，在游離狀態(tài)下還發(fā)現(xiàn)了血液循環(huán)中部分重要的miRNA［15］。在人血循環(huán)中處于游離狀態(tài)的細胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs），根據(jù)其直徑不同，可分為四個亞群，它是外泌體（Exosomes，EXs）、微泡（Microvesicles，MVs）、凋亡小體（Apoptosis bodies，Apo-BDs）和癌小體（Oncosomes）的混合物，含有可被認為是介導細胞間通訊的一類新的信號分子［16-17］，癌小體是最新發(fā)現(xiàn)的類別［18］，而EXs是目前研究的熱點。隨后也證明循環(huán)的體液中（尿液、唾液、眼淚和母乳）含有大量的miRNA［19］。此外，循環(huán)miRNA非常穩(wěn)定，其對于不同的溫度、pH、儲存時間或者反復凍融都有很好的耐受性，這支持了循環(huán)miRNA作為理想生物標志物的用途，并且使用實時定量聚合酶鏈反應（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）相對容易檢測［4］。重要的是，越來越多的研究已經(jīng)發(fā)表。目前關于循環(huán)miRNA的研究僅限于單個感興趣的miRNA，本文通過查閱文獻盡可能收集相關循環(huán)miRNA的研究成果，探討循環(huán)miRNA表達的異常與T2DM的發(fā)生、發(fā)展的關系。

2 T2DM受試者循環(huán)miRNA的特點研究

多數(shù)研究表明，miRNA具有T2DM生物標志物的潛能（表1），當采用qPCR和（或）microarray去檢測循環(huán)miRNA時，發(fā)現(xiàn)當miRNA轉(zhuǎn)錄為mRNA時受到正向調(diào)控，表達上調(diào)；當miRNA受到抑制時，表達下調(diào)；部分循環(huán)miRNA表達無變化，其原因有兩方面，其一是反義RNA與miRNA結(jié)合后，序列很短，導致Dicer酶不能有效結(jié)合；其二是miRNA與Ago2以RISC復合物的形式存在，該復合物也會導致Dicer酶無法有效結(jié)合。綜上，循環(huán)miRNA可能是預測T2DM的診斷工具，這些miRNA可能與T2DM的發(fā)病有關，這些miRNA可以在Pre-DM人群作為預測該病發(fā)生的工具。

表1 T2DM受試者循環(huán)miRNA的特點研究

續(xù)表1 T2DM受試者循環(huán)miRNA研究的特點

續(xù)表1 T2DM受試者循環(huán)miRNA研究的特點

3 不同循環(huán)miRNA和T2DM相關性研究

3.1 循環(huán)miRNA和T2DM相關性的異質(zhì)性研究JIMéNEZ-LUCENA R等［2］通過60個月的中位隨訪調(diào)查，觀察到各組間血漿miR-9、miR-28-3p、miR-29a、miR-103、miR-126和miR-375的基線血漿水平顯著低于非T2DM患者，各組間血漿miR-7和miR-320水平無顯著差異。Cox回歸分析顯示，miR-28-3p、miR-29a和miR-9水平低的患者具有更高的疾病風險（HR=11.27；95%CI=2.61～48.65），模型的AUC為0.834。更重要的是，相關研究結(jié)果顯示，miRNA水平的改變比T2DM的發(fā)展早了3年，因此，模型在這段時間內(nèi)更具有預測能力。ZAMPETAKI A等［20］、WAN S等［21］調(diào)查了T2DM診斷前的miRNA血漿水平，顯示miR-9的血漿水平可能被用作預測性生物標志物。發(fā)現(xiàn)30個微小核糖核酸在T2DM個體中有差異表達。其中包括miR-126和miR-320減少以及miR-28-3p增加。KONG L等［22］研究結(jié)果顯示，與T2DM易感個體和健康對照組相比，新診斷的患者血 清 中miR-9、miR-29a、miR-375顯 著 上 調(diào)（P=0.0030），這意味著它有作為T2DM生物標志物的潛力，這些微小核糖核酸都與胰島素調(diào)節(jié)有關。PORDZIK J等［19］研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-320a和miR-375在T2DM被上調(diào)，并且該研究加強了miR-9、miR-29a和miR-375可能在胰島素調(diào)節(jié)和T2DM發(fā)病中發(fā)揮作用的假設。

3.1.1 循環(huán)miR-7和T2DM相關性研究WAN S等［21］研究發(fā)現(xiàn)T2DM患者血清miR-7顯著升高（P＜0.001），循環(huán)miR-7主要以游離外泌體形式存在，而不是以膜結(jié)合外泌體形式存在，研究充分表明miR-7水平的增加與T2DM的發(fā)生和發(fā)展有關。此外，與健康對照組相比，在T2DM患者中，血清miR-7水平與血清葡萄糖呈正相關，這表明循環(huán)miR-7與β細胞功能障礙和胰島素分泌受損有關。WAN S等［21］和JIMéNEZ-LUCENA R等［2］關于miR-7的研究結(jié)果有差異，這可能和選用的樣品（血清和血漿）和調(diào)查方法（病例對照研究和隊列研究）有關。需要進一步的研究去驗證miR-7是上調(diào)還是下調(diào)。

3.1.2 循環(huán)miR-9和T2DM相關性研究KONG L等[22]研究發(fā)現(xiàn)，與T2DM易感個體和健康對照組相比，新診斷的T2DM患者血清中miR-9顯著上調(diào)。PORDZIK J等[19]研究加強了miR-9可能在胰島素調(diào)節(jié)和T2DM發(fā)病中發(fā)揮作用的假設。JIMéNEZ-LUCENA R等[2]通過60個月的中位隨訪觀察發(fā)現(xiàn)，在T2DM患者中，miR-9的基線血漿水平顯著低于非T2DM個體，研究顯示miR-9下調(diào)，并且血漿miR-9水平較低的患者發(fā)生T2DM的風險較高，研究首次證明了血漿中miR-9的水平也是可以區(qū)分T2DM患者和非T2DM個體強有力的預測性生物標志物。其中JIMéNEZ-LUCENA R等[2]和KONG L等[22]關于miR-9的研究出現(xiàn)了差異表達，這可能與選用的樣品（血漿和血清）和調(diào)查方法（隊列研究和病例對照研究）有關，需要進一步的研究去驗證miR-9是上調(diào)還是下調(diào)。

3.1.3 循環(huán)miR-28-3p和T2DM相關性研究CHIEN H Y等［12］、PORDZIK J等［19］和ZAMPETAKI A等［20］報道了與非T2DM個體相比，T2DM患者血漿中的miR-28-3p上調(diào)。DE CANDIA P等［23］研究顯示，與正常糖代謝（Normal glucose metabolism，NGT）受試者相比，糖耐量受損（Impaired glucose tolerance，IGT）患者的血漿miR-28-3p下調(diào)。和JIMENEZ-LUCENA R等［2］關于miR-28-3p的研究出現(xiàn)了差異表達，這可能與檢測方法（qRT-PCR與microarray和qRT-PCR）有關，需要進一步的研究去驗證miR-28-3p是上調(diào)還是下調(diào)。

3.1.4 循環(huán)miR-29a和T2DM相關性研究LIANG Y-Z等［24］研究發(fā)現(xiàn)miR-29a的表達水平在T2DM患者和健康對照組之間有顯著差異。在一項隊列研究中，新診斷的T2DM患者血清中的miR-29a與T2DM易感且NGT受試者相比顯著增加，這意味著它們具有作為T2DM生物標志物的潛力。KONG L等［22］研究發(fā)現(xiàn)，與NGT受試者相比，新診斷的患者血清中miR-29a顯著上調(diào)，miR-29a與胰島素調(diào)節(jié)有關。miR-29a是T2DM、空腹血糖升高（Impaired fasting glucose，IFG）甚至胰島素抵抗（Insulin resistance，IR）重要的獨立預測因子。根據(jù)最近對血清和血漿的兩項研究發(fā)現(xiàn)，在觀察2年的隨訪樣本中，miR-29a與T2DM顯著相關［25］。其中JIMENEZ-LUCENA R等［2］和KONG L等［22］關于miR-29a的研究出現(xiàn)了差異表達，可能與選用的樣品（血漿和血清）和調(diào)查方法（隊列研究和病例對照研究）有關，需要進一步的研究去驗證miR-29是上調(diào)還是下調(diào)。

3.1.5 循環(huán)miR-320和T2DM相關性研究KAROLINA D S等［25］對健康對照者和T2DM患者血清miRNA的表達譜進行研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照者相比，T2DM患者外泌體中的miR-320a水平上調(diào)。miR-320a和T2DM患者之間可能存在聯(lián)系，在T2DM患者的血清中miR-320a的表達量均顯著高于對照組，這兩種情況下miR-320a均存在失調(diào)。此外，miR-320a的表達與空腹血糖水平呈強正相關，從而突出了它在Pre-DM患者中的關鍵作用。YAN S等［26］通 過qRT-PCR和microarray鑒 定出NGT受 試者、Pre-DM人群和新診斷的T2DM患者miR-320b表達有顯著差異。通過比較從NGT受試者、Pre-DM人群和T2DM患者獲得的microarray數(shù)據(jù)，與NGT受試者相比，人血清蛋白中的miR-320b在Pre-DM人群和T2DM患者中下調(diào)，相關的數(shù)據(jù)也證明了利用血漿miRNA來區(qū)分NGT受試者、Pre-DM人群和T2DM患者的可行性。和JIMéNEZ-LUCENA R等［2］關于miR-320的研究出現(xiàn)了差異表達，這可能與檢測方法（qRT-PCR和microarray）有關，需要進一步的研究去驗證miR-320是上調(diào)還是下調(diào)。

3.1.6 循環(huán)miR-375和T2DM相關性研究KAROLINA D S等［25］研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，T2DM患者外泌體中的miR-375水平上調(diào)。相關研究顯示［39-41］，miR-375的水平相對穩(wěn)定，與健康對照組相比，在T2DM中，血清miR-375幾乎沒有變化［41］。這很可能是由胰島中miR-375的高豐度和穩(wěn)定性以及廣泛靶網(wǎng)絡有關。SEYHAN A A等［27］研究顯示，當校正了年齡、性別和體重指數(shù)的混雜影響后，血漿中miR-375的表達在健康對照組和Pre-DM人群和T2DM患者之間沒有差異。因此，必須有額外的解釋為什么循環(huán)的miR-375水平在T2DM患者中沒有改變。HIGUCHI C等［11］測量了T2DM患者和NGT受試者的miRNA的血清水平。與NGT受試者相比，循環(huán)中的miR-375水平在T2DM患者中增加，并且可能是T2DM新型的生物標志物。JIMéNEZ-LUCENA R等［2］通過60個月的中位隨訪調(diào)查顯示，血漿miR-375在T2DM發(fā)病前就已被解除相關，應作為新的生物標志物進一步探索。關于miR-375的研究出現(xiàn)了差異表達，這可能與選用的樣品（血漿、血清、外泌體）有關，需要進一步的研究去驗證miR-375是上調(diào)還是下調(diào)。

綜上，不同學者研究結(jié)果顯示，循環(huán)miR-7、循環(huán)miR-28-3p、循 環(huán)miR-29、循 環(huán)miR-320和 循 環(huán)miR-375失調(diào)的方向是不一致的，結(jié)果不一致可能與不同實驗中不同的納入/排除標準、樣本量、選用樣品、調(diào)查方法和實驗方法有關，從而導致不同發(fā)表結(jié)果之間難以解釋和比較。如果找到合適的研究方法，盡可能控制混雜因素對實驗的影響，再去鑒定其功能，對T2DM的研究仍然有重要的意義。

3.2 循環(huán)miRNA和T2DM相關性的同質(zhì)性研究

3.2.1 循環(huán)miR-103和T2DM相關性研究LUO M等［5］在研究中使用個體血清和血漿，在區(qū)分健康對照個體與Pre-DM和T2DM受試者時，其AUC分別為0.901和0.998；而區(qū)分Pre-DM受試者和T2DM患者時，其AUC為0.890。結(jié)果表明血清和血漿中循環(huán)miR-103a水平顯著升高。在區(qū)分健康對照個體與Pre-DM和T2DM受試者時，其AUC分別為0.999和0.964；而區(qū)分Pre-DM受試者和T2DM患者時我們還檢測到血漿中miR-103b水平顯著降低，其AUC為0.474，結(jié)果表明血清和血漿中循環(huán)miR-103b水平顯著降低，證明了循環(huán)miR-103a和循環(huán)miR-103b的相互變化不僅為區(qū)分T2DM患者和Pre-DM人群提供了高靈敏度和特異性，而且表示循環(huán)miR-103a和miR-103b可作為T2DM診斷的新型生物標志物，具有較高的診斷價值。在研究中，學者們還證明了使用循環(huán)miR-103a和miR-103b來區(qū)分健康對照者、Pre-DM人群和T2DM患者的可行性。數(shù)據(jù)表明，循環(huán)miR-103家族在診斷性能方面優(yōu)于其他已被鑒定為T2DM生物標志物的miRNA，總的來說，目前的工作表明miR-103a和miR-103b可以在血清和血漿中有效地測量。

3.2.2 循環(huán)miR-122和T2DM相關性研究WILLEIT P等［28］成功量化了826名受試者中810名的循環(huán)miR-122水平。血清和血漿中MiR-122水平高度相關（r=0.86；95%CI：0.84～0.88）。研究首次表明，在血清和血漿中測量的循環(huán)miR-122的基線水平與T2DM高度相關，循環(huán)miR-122水平升高。DE CANDIAP等［23］研究發(fā)現(xiàn)，miRNA濃度可能會隨著葡萄糖耐量受損而升高，葡萄糖耐量受損與血漿miRNA的整體增加有關，與T2DM患者相比，miR-122水平升高。與NGT受試者相比，差異表達的miR-122-5p在IGT傾向于升高。在一項對T2DM患者的研究中，miR-122的血清水平顯著升高［24］。

3.2.3 循環(huán)miR-126和T2DM相關性研究ZHANG T等［29］和KATAYAMA M等［30］研究 發(fā) 現(xiàn)，在T2DM易感個體和T2DM患者的血漿樣品中，miR-126的水平顯著下調(diào)（P＜0.01），ZHANG T等［29］還揭示了血漿miR-126水平的下調(diào)與T2DM發(fā)展的風險相關。值得注意的是，ZHANG T等［4］和ZAMPETAKI A等［20］研究表明，miR-126是唯一一種在易感個體和T2DM患者中表達顯著低于正常個體的miRNA。ZHANG T等［4］研究顯示，miR-126是內(nèi)皮凋亡小體中最豐富的miRNA，內(nèi)皮凋亡小體中miR-126的含量以葡萄糖依賴的方式減少，因為凋亡小體和微泡可以轉(zhuǎn)移到其他細胞，低血漿水平可能導致miR-126向單核細胞的傳遞減少，并導致血管內(nèi)皮生長因子抵抗和內(nèi)皮功能障礙。AL-KAFAJI G等［31］揭示了血清miR-126是用于篩查Pre-DM人群和T2DM患者新型的生物標志物，SEYHAN A A等［27］研究也顯示，Pre-DM人群miR-126水平顯著降低。GIANNELLA A等［32］觀察到血漿miR-126-3p的表達從Pre-DM人群到T2DM患者逐漸降低，此外，研究首次發(fā)現(xiàn)血漿中miR-126-3p含量與空腹血糖水平呈負相關，表明該生物標志物具有嚴格的血糖敏感性。OLIVIERI F等［33］研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照者相比，在T2DM患者中觀察到血漿miR-126-5p水平降低。檢驗miR-126表達的減少是否能預測易感個體T2DM的發(fā)作，學者們的結(jié)果支持了循環(huán)中的miR-126可以發(fā)展成一種非侵入性的快速診斷工具，用于預測易感T2DM的個體，結(jié)果表明，與健康對照組相比，血漿miR-126是僅在易感個體和T2DM患者中顯著降低表達。綜上，OLIVIERI F等［33］的觀點有待完善，與健康對照組相比，循環(huán)miR-126在Pre-DM人群也出現(xiàn)水平下調(diào)。miR-126和T2DM之間有顯著相關性。重要的是，在T2DM出現(xiàn)之前，miR-126已經(jīng)改變，提示miR-126是T2DM發(fā)病的預測因子［4］。WITKOWSKI M等［34］研究的數(shù)據(jù)加強了miR-126在T2DM發(fā)生、發(fā)展中的作用。相關學者還發(fā)現(xiàn)，miR-126是與T2DM最相關的miRNA也是對相關循環(huán)miRNA進一步研究的重點［21，29，35-36］。

3.2.4 循環(huán)miR-192和T2DM相關性研究多項研究［19，25，42］分析了IGT和T2DM患者的miR-192，發(fā)現(xiàn)T2DM患者中miR-192有所表達，與健康對照者相比，T2DM患者外泌體中的miR-192水平上調(diào)。JAEGER A等［43］的一項研究中，與健康對照組相比，T2DM患者的血清miR-192水平顯著升高，鑒定并驗證了血清miR-192水平的升高是T2DM潛在的生物標志物。綜上研究，miR-192均顯示為上調(diào)，應作為下一步研究的重點。

綜上，不同學者研究表明，循環(huán)miR-103、循環(huán)miR-122、循環(huán)miR-126和循環(huán)miR-192失調(diào)的方向是一致的，其可能成為T2DM潛在的循環(huán)生物標志物，應作為下一步研究的重點。

4 展望

在這篇綜述中，我們描述了目前用于檢測和研究微小核糖核酸的方法，并總結(jié)了迄今為止循環(huán)miRNA在T2DM中的研究。循環(huán)miRNA作為基因調(diào)控的重要開關，能參與幾乎所有生理病理活動，可能是T2DM早期診斷的生物標志物和潛在的治療靶點，差異表達的miRNA表達譜可以作為T2DM預測或疾病進展的良好指標，然而，來自不同研究間的差異需要進一步去證明。如果找到恰當?shù)姆椒ūM可能去控制其混雜因素，將對于開發(fā)和應用miRNA提供巨大幫助。