張自偉，王懷遠(yuǎn)，張 武

（1.皖南醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；2.潁上縣公安局刑事科學(xué)技術(shù)室，安徽 潁上 236200）

芬太尼是一種高效阿片類鎮(zhèn)痛藥，其鎮(zhèn)痛效力為嗎啡的50～100倍，1963年開始應(yīng)用于臨床，作為一種鎮(zhèn)痛劑主要用于治療慢性疼痛［1］。近年來芬太尼及其衍生物濫用問題日益嚴(yán)重，甚至有麻醉意外中毒（死）和濫用中毒（死）的報(bào)道［2-4］。2019年5月1日起中國正式對芬太尼作為合法藥物使用進(jìn)行整類列管，但和芬太尼相關(guān)的案件在司法鑒定工作中仍屢屢遇到。因此，建立快速靈敏、簡單易行的芬太尼定性和定量分析方法是十分必要的。生物樣本中目標(biāo)物的分析方法建立時(shí)應(yīng)該采用適當(dāng)?shù)臉悠非疤幚矸椒?。芬太尼的樣品前處理方法?jīng)常使用的有液液萃取法、固相萃取法和化學(xué)衍生法等［5］。其中化學(xué)衍生法可以提高目標(biāo)物在生物檢材中的靈敏度，但是其樣品前處理耗時(shí)且需要相應(yīng)的衍生試劑；固相萃取法具有樣品雜質(zhì)干擾少的優(yōu)點(diǎn)，但是裝置相對復(fù)雜且需要相應(yīng)的固相萃取小柱，實(shí)驗(yàn)成本高；液液萃取法具有價(jià)格低廉、裝置和操作簡單的優(yōu)勢，并且其回收率優(yōu)于蛋白質(zhì)萃取法［5］。綜合考慮這幾種樣品前處理方法，液液萃取法對于生物樣本中芬太尼的前處理分析最具優(yōu)勢。目前已報(bào)道的生物樣本中芬太尼的分析方法主要包括免疫分析法［6-7］、流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法（CL）［8］、高效液相色譜法（HPLC）［9］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）［10-12］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）［13-15］。已報(bào)道的這些方法中，免疫分析法測定步驟多、操作煩瑣；流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法選擇性不高且重復(fù)性較差；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有靈敏度高和選擇性好的優(yōu)點(diǎn)，但儀器設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，不具有普遍性。高效液相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法由于準(zhǔn)確度高、精密度好等優(yōu)點(diǎn)，最適合用于生物樣本中芬太尼的檢測。本研究面向日常鑒定工作的需要，首先優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件建立了高效液相色譜-二極管陣列檢測器法（HPLC-DAD）定性分析芬太尼，在此工作基礎(chǔ)上，進(jìn)一步建立了一種基于液液萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LLE-GC-MS）定量分析生物樣本中的芬太尼。色譜定性和定量分析方法具有樣品前處理簡單、適用范圍廣的優(yōu)點(diǎn)，能夠用于快速篩查和精準(zhǔn)測量生物樣本中的芬太尼。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑甲醇（色譜純，Merck公司）；乙腈（色譜純，Merck公司）；乙醚（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；磷酸二氫鉀（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；無水硫酸鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；中性氧化鋁（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；pH緩沖劑（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；pH試紙（1～14）；芬太尼標(biāo)準(zhǔn)品（1.0 mg·mL-1,美國Cerilliant公司)；超純水（電阻率18.2 M?·cm）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器島津GCMS-QP2010 ultra，安捷倫HPLC 1260（DAD檢測器），KH5200型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司），800型電動(dòng)離心機(jī)（江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠），TGL-16B高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），WH-3微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠），SHANGPING FA1004電子分析天平（上海天平儀器廠），ST3100/F酸度計(jì)［奧豪斯儀器（常州）有限公司］，ELGApurelab flex2超純水儀（電阻率18.2 MΩ·cm，英國），Eppendorf微量加樣器（20～200μL），普通冰箱，HH-420型電熱恒溫水溫箱（紹興博緯儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HPLC-DAD定性分析條件色譜柱ZORBAX SB-C18柱（4.6×150 mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈∶水（0.015 mol·L-1KH2PO4，pH=5）=40∶60，流速1 mL·min-1。檢測波長205 nm，帶寬2 nm；參比波長360 nm，帶寬100 nm；柱溫室溫；進(jìn)樣量5μL。

1.2.2 LLE-GC-MS定性與定量分析條件

1.2.2.1 芬太尼定性分析色譜條件：色譜柱Rxi-5Sil MS柱（30.0 m×0.25 mm×0.25μm）；升溫程序?yàn)?00℃保持1.5 min，25℃·min-1升溫速率到280℃，保持15 min。柱箱溫度100℃，進(jìn)樣口溫度250℃，流量控制方式為壓力模式，總壓力為72.7 kPa，柱流量1 mL·min-1。手動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量1μL。質(zhì)譜條件：電離能70 eV，接口溫度280℃，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃。檢測器電壓0.2 kV（相對于調(diào)諧結(jié)果），載氣：He，流量1 mL·min-1（恒流模式）。溶劑延遲時(shí)間3 min，開始時(shí)間3.5 min，結(jié)束時(shí)間23.7 min，采集方式全掃描模式（FULL SCAN），間隔0.5 sec，掃描速度1 000，開始（m/z）50，結(jié)束（m/z）500，分流比為50∶1。采集方式選擇離子監(jiān)測（SIM），分流比5∶1。

1.2.2.2 芬太尼定量分析芬太尼的定量采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，將芬太尼標(biāo)準(zhǔn)溶液添加至空白血液中配制成濃度為1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、10 ng·mL-1、100 ng·mL-1、500 ng·mL-1的系列樣品。按文中方法進(jìn)行前處理和分析，采集方式選擇離子監(jiān)測，芬太尼m/z245。以芬太尼的濃度為橫坐標(biāo)（C），目標(biāo)物的峰面積為縱坐標(biāo)（A）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程?=aC＋b，根據(jù)回歸方程計(jì)算得到樣品中芬太尼的濃度C。

1.2.3 溶液配制100.0μg·mL-1芬太尼儲備液配制：移取100μL母液（1.0 mg·mL-1）用甲醇稀釋到1 mL。10μg·mL-1芬太尼工作溶液：移取1 000μL 100.0μg·mL-1芬太尼儲備液用甲醇稀釋到10 mL。芬太尼儲備液和工作溶液在4℃條件下冷藏保存，每2周重新配制。

1.2.4 生物樣品血液和胃內(nèi)容物的前處理方法本實(shí)驗(yàn)中所用的血液及胃內(nèi)容物樣品均由安徽省潁上縣公安局合法提供，符合皖南醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)規(guī)定。

1.2.4.1 血液前處理移取2 mL的血液樣品置于10 mL離心管中，滴加10%氫氧化鈉溶液調(diào)制溶液至堿性（pH=11～12），加3 mL乙醚，渦旋2 min后，離心（轉(zhuǎn)速2 000 r·min-1）2 min，取上清液于60℃水浴揮至近干。處理過的血液再用50μL甲醇復(fù)溶得到血液樣品溶液。血液樣品中芬太尼測試，取1μL上述血液樣品溶液手動(dòng)進(jìn)樣。

1.2.4.2 胃內(nèi)容物前處理稱取約1 g的胃內(nèi)容物，滴加10%氫氧化鈉溶液調(diào)制溶液至堿性（pH=11～12），加3 mL乙醚，渦旋2 min后，以2 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心2 min，取離心后的上清液加適量無水硫酸鈉和中性氧化鋁以除去生物樣品中內(nèi)源性脂肪、蛋白質(zhì)、色素等，用漏斗過濾，濾液用0.45μm有機(jī)膜過濾后于60℃水浴揮至近干。殘?jiān)?00μL甲醇復(fù)溶得到胃內(nèi)容物樣品溶液。胃內(nèi)容物中芬太尼測定時(shí)取1μL上述胃內(nèi)容物樣品溶液手動(dòng)進(jìn)樣。

1.2.5 LLE-GC-MS標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制將芬太尼工作溶液用甲醇稀釋得到濃度分別為1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、10 ng·mL-1、100 ng·mL-1、500 ng·mL-1的芬太尼溶液；將100μg·mL-1芬太尼儲備液用甲醇稀釋分別得到濃度為5μg·mL-1、10μg·mL-1、20μg·mL-1、50μg·mL-1、100μg·mL-1的芬太尼溶液。

1.2.6 LLE-GC-MS分析時(shí)方法學(xué)驗(yàn)證

1.2.6.1 芬太尼標(biāo)準(zhǔn)樣品冷藏穩(wěn)定性芬太尼溶液（5μg·mL-1）4℃下放置7天內(nèi)進(jìn)樣，在建立的GC-MS條件下分析?？疾旆姨岢龇鍟r(shí)間和峰面積的變化。

1.2.6.2 特異性取1份空白血液（不含有檢測目標(biāo)物或檢測對象的血液樣本）添加10μg·mL-1的甲基苯丙胺、氯胺酮和哌替啶，按文中方法進(jìn)行前處理和分析。

1.2.6.3 檢出限、定量限和線性取空白血液加入芬太尼標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成一系列濃度的血液樣品，按文中方法進(jìn)行前處理和分析。信噪比≥3時(shí)對應(yīng)的濃度即為本方法檢出限，信噪比≥10時(shí)對應(yīng)的濃度即為本方法定量限。定量限樣品的精密度和準(zhǔn)確度符合要求。

將芬太尼標(biāo)準(zhǔn)溶液添加至空白血液中配制成濃度 為1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、10 ng·mL-1、100 ng·mL-1、500 ng·mL-1的樣品，按文中方法進(jìn)行前處理和分析。

1.2.6.4 精密度和準(zhǔn)確度取空白血液，配制成濃度為10μg·mL-1和100μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)添加樣品，每個(gè)濃度配制5個(gè)樣品，連續(xù)測定3天，根據(jù)測定結(jié)果計(jì)算GC-MS方法的日內(nèi)、日間精密的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviation，RSD）值。

1.2.6.5 回收率取空白血液，配制成濃度為2 ng·mL-1、10 ng·mL-1、100 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)添加樣品，按文中方法進(jìn)行前處理和分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)添加結(jié)果和測定結(jié)果，計(jì)算回收率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件對所得結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，由均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示處理后的數(shù)據(jù)。采用一元回歸分析建立芬太尼的峰面積與濃度之間的回歸方程，對回歸方程進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 LLE-GC-MS分析時(shí)提取pH和提取溶劑的選擇芬太尼是一種堿性化合物，文獻(xiàn)報(bào)道的芬太尼的pKa是8.4［10］。實(shí)驗(yàn)中最終選擇了pH=11～12的堿性條件和乙醚提取溶劑。

2.2 HPLC-DAD法定性分析芬太尼通過全光譜掃描最終確定了205 nm作為測定波長。流動(dòng)相的選擇上，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)乙腈相較于甲醇色譜基線平穩(wěn)、儀器柱壓更低，因此選擇基于乙腈的流動(dòng)相，并同時(shí)優(yōu)化了乙腈和水的比例，確定流動(dòng)相乙腈∶水=40∶60的流動(dòng)相組成。該條件下芬太尼的出峰時(shí)間為3.356 min。HPLC-DAD法的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰見圖1。

圖1 Fentanyl的高效液相色譜圖

2.3 LLE-GC-MS方法驗(yàn)證

2.3.1 穩(wěn)定性結(jié)果顯示考察時(shí)間內(nèi)芬太尼的出峰時(shí)間變化小，峰面積波動(dòng)較小，由出峰時(shí)間和峰面積計(jì)算相對偏差分別＜3%，穩(wěn)定性結(jié)果見圖2。7天4℃冷藏條件下芬太尼峰形穩(wěn)定，無分解峰，濃度不改變，標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性好。

圖2 峰面積和保留時(shí)間穩(wěn)定性結(jié)果

2.3.2 特異性在優(yōu)化的LLE-GC-MS的實(shí)驗(yàn)條件下，我們考察了本方法對芬太尼以及毒（品）物分析中經(jīng)常涉及的甲基苯丙胺、氯胺酮、哌替啶的響應(yīng)情況。結(jié)果顯示芬太尼的保留時(shí)間為14.017 min，見圖3，其主要特征離子峰分別為245、146、202。在相同的分析條件下，甲基苯丙胺的出峰時(shí)間是4.325 min，氯胺酮的出峰時(shí)間是8.437 min，哌替啶的出峰時(shí)間是13.125 min。在相同的分析條件下，我們用該方法對空白血液、待測血液以及待測胃內(nèi)容物進(jìn)行了分析測試，其總離子流圖見圖4。空白血液在芬太尼出峰位置附近沒有干擾峰（紅線），待測血液（綠線）和胃內(nèi)容物（藍(lán)線）在14 min附近有芬太尼的色譜峰出現(xiàn)，且和內(nèi)源性物質(zhì)的峰達(dá)到基線分離，滿足定性定量分析要求。

圖3 10μg·mL-1芬太尼標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流出圖

圖4 空白和待測樣品總離子流出圖

2.3.3 檢出限、定量限和線性LLE-GC-MS法分析對血液中芬太尼的濃度在1～500 ng·mL-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為：?=24.84C＋887.78，相關(guān)系數(shù)r為0.999 4，檢出限為0.02 ng·mL-1，定量限為1.0 ng·mL-1。

2.3.4 準(zhǔn)確度、精密度和回收率芬太尼測定的準(zhǔn)確度為90.33%～109.98%，日內(nèi)精密度和日間精密度均為2.53%～3.00%。標(biāo)準(zhǔn)添加樣品的回收率為69.6%～72.8%。

2.3.5 LLE-GC-MS分析方法的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用某50歲男性自行服用從外地購買的戒毒藥物后出現(xiàn)嗜睡、嘔吐等不適，繼而死亡。用本文建立起來的液液萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LLE-GC-MS）檢測了死者的血液和胃內(nèi)容物，測定結(jié)果見表1。血液中檢出了芬太尼，含量為（25.76±0.65）ng·mL-1；胃內(nèi)容物中檢出了芬太尼，含量為（0.51±0.03）μg·g-1。

表1 待測樣品定量參數(shù)和測定結(jié)果

3 討論

生物樣本中芬太尼的定性和定量分析在司法實(shí)踐中有重要意義，色譜法具有準(zhǔn)確度好、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。合理的樣品前處理方法是色譜分析的關(guān)鍵，本實(shí)驗(yàn)首先優(yōu)化了樣品前處理的pH和提取溶劑。實(shí)驗(yàn)中考慮到芬太尼的酸度系數(shù)(pKa)是弱堿性，堿性條件使芬太尼結(jié)構(gòu)中的氮元素最大可能地轉(zhuǎn)化為三級胺進(jìn)入有機(jī)相，抑制解離最適宜的pH為高于該毒物pKa的1～2。因此本實(shí)驗(yàn)選擇了pH=11～12的堿性條件作為生物樣本中芬太尼提取的pH條件，該條件也是血液中常見藥（毒）物分析中廣泛使用的條件。因而，該方法中的提取條件在生物樣品藥（毒）物分析中具有較普遍的適用性。另一方面，生物樣本（血液、尿液）中芬太尼的提取溶劑文獻(xiàn)已報(bào)道的有正己烷-乙醇、正己烷-二氯甲烷-異丙醇、乙酸乙酯：氨水等。由于乙醚的沸點(diǎn)低、溶劑去除時(shí)可以通過簡單的水浴方法，實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡單、操作方便。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇乙醚作為生物樣本中芬太尼的提取溶劑。生物樣本中芬太尼的定性分析是通過優(yōu)化高效液相色譜-二極管陣列檢測器法（HPLC-DAD）檢測波長、洗脫溶劑和梯度，建立起可用于芬太尼濃度含量高的樣本分析方法，實(shí)驗(yàn)中觀察到最佳流動(dòng)相條件下，柱壓較低、基線平穩(wěn)。同時(shí)，樣品中芬太尼和標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間基本一致，峰型對稱性較好，可以滿足定性分析要求。盡管本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC-DAD測定芬太尼具有分析時(shí)間短（3.356 min）的優(yōu)點(diǎn)，但是不適于芬太尼含量較低（＜0.05μg·mL-1）的生物樣本。在此實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，為了克服HPLC-DAD法的實(shí)際應(yīng)用的不足，通過優(yōu)化儀器和實(shí)驗(yàn)條件建立了液液萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LLE-GC-MS）的芬太尼定量分析方法，并用于血液和胃內(nèi)容物中芬太尼的快速測定。總之，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化并建立了高效液相色譜-二極管陣列檢測器法（HPLC-DAD）定性分析芬太尼和液液萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LLE-GC-MS）定量分析芬太尼的方法。HPLC-DAD法樣品具有分析時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，但無法滿足恒量濃度芬太尼樣品的分析測定。因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)而建立了芬太尼快速測定的LLE-GC-MS法。LLE-GC-MS法樣品前處理簡單，靈敏度好，準(zhǔn)確率高，實(shí)用性強(qiáng)，適用面廣，適用于法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)和司法鑒定活動(dòng)中涉及的芬太尼的檢測，同時(shí)LLE-GC-MS法也適用于臨床上芬太尼藥物濃度的監(jiān)測。