馮小麗，李明華，韓建保，瞿 望，都洪弟，鄧忠華，鄭永唐，2

（1.中國科學(xué)院昆明動物研究所，國家昆明高等級生物安全靈長類動物實驗中心，中國科學(xué)院生物安全大科學(xué)研究中心；2.中國科學(xué)院昆明動物研究所，中國科學(xué)院動物模型與人類疾病機(jī)理重點實驗室，云南 昆明 650223）

2019年12月，湖北省武漢市暴發(fā)了不明原因引起的肺炎，后續(xù)研究證實該肺炎由一種新型冠狀病毒引起，2020年2月11日，世界衛(wèi)生組織（Word Health Organization，WHO）將這一新發(fā)傳染病正式命名為新型冠狀病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19），同時，國際病毒分類委員會將這一新型冠狀病毒命名為SARS-CoV-2（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2）。根據(jù)WHO發(fā)布的數(shù)據(jù)，全球有211個國家和地區(qū)報告了COVID-19疫情，遍布世界5大洲。截至2021年6月17日24時，中國大陸累計報告確診病例91 534例，累計死亡病例4 636例。中國大陸以外國家和地區(qū)累計報告確診病例178 347 369例，累計死亡病例3 854 881例（https：//www.who.int）。COVID-19疫情對人類健康和世界公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了重大威脅［1］。

2020年1月20日國家衛(wèi)生健康委員會將新型冠狀病毒肺炎納入法定傳染病乙類管理［2］，并采取甲類傳染病的預(yù)防和控制措施。2020年1月23日國家衛(wèi)生健康委員會要求SARS-CoV-2病原體暫按照病原微生物危害程度分類中第二類病原微生物進(jìn)行管理［3］。因此所有涉及SARS-CoV-2活病毒的分離、培養(yǎng)、動物感染等實驗活動均要求在生物安全三級（BSL-3/ABSL-3）實驗室內(nèi)進(jìn)行，由于SARS-CoV-2傳染性強(qiáng)，人群普遍易感［4］，因此加強(qiáng)BSL-3/ABSL-3實驗室的生物安全防護(hù)尤為重要。

筆者所在的中國科學(xué)院昆明動物研究所國家昆明高等級生物安全實驗中心于2020年2月獲得新型冠狀病毒CNAS（China National Accreditation Service for Conformity Assessment）認(rèn)可證書及國家衛(wèi)生健康委員會活動資質(zhì)批復(fù)。開展了SARS-CoV-2的分離培養(yǎng)、SARS-CoV-2感染靈長類動物模型建立［5］、SARS-CoV-2感染小鼠動物模型建立［6］、SARS-CoV-2感染樹鼩動物模型建立［7］、抗SARS-CoV-2的藥物活性評價［8］等工作。

本文結(jié)合筆者在BSL-3/ABSL-3實驗室開展SARS-CoV-2實驗活動的實踐經(jīng)驗，就生物安全防護(hù)，包括個人防護(hù)、實驗操作、實驗后清場消毒等各個環(huán)節(jié)的風(fēng)險及生物安全防護(hù)措施進(jìn)行了概述，以供相關(guān)實驗室參考。

1 COVID-19流行病學(xué)特點及實驗室暴露風(fēng)險因素

1.1 傳染源傳染源主要是新型冠狀病毒感染的患者和無癥狀感染者，在潛伏期即有傳染性，發(fā)病后5天內(nèi)傳染性較強(qiáng)［9］。

1.2 傳播途徑主要傳播途徑是經(jīng)呼吸道飛沫傳播和密切接觸傳播。接觸病毒污染的物品也可能造成感染，在相對封閉的環(huán)境中長時間暴露于高濃度氣溶膠情況下存在經(jīng)氣溶膠傳播的可能。在糞便、尿液中也能分離到新型冠狀病毒，所以有對環(huán)境污染造成SARS-CoV-2接觸傳播或氣溶膠傳播的可能。

1.3 SARS-CoV-2的傳染性和致病性SARS-CoV-2屬于高致病性病原體，具有較強(qiáng)的傳染性。人際傳播指數(shù)（R0，basic reproduction number）作為衡量某一病原體傳染性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)，數(shù)值越大傳染性就越強(qiáng)。據(jù)報道，SARS-CoV-2的R0值在1.4～6.49之間，即每一個受染者可將病毒傳染給2～7個正常人［10-12］。人群對SARS-CoV-2普遍易感，感染后或接種新型冠狀病毒疫苗后可獲得一定免疫力，但持續(xù)時間尚不明確。潛伏期一般為1～14 d，多為3～7 d，感染SARS-CoV-2后的臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱、干咳和乏力等，少數(shù)患者可伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹瀉等癥狀，重癥患者多在發(fā)病1周后出現(xiàn)呼吸困難和/或低氧血癥，嚴(yán)重者可快速進(jìn)展為嚴(yán)重急性呼吸綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒和凝血功能障礙及多器官功能衰竭等［13-15］。多數(shù)患者預(yù)后良好，少數(shù)患者病情危重，特別是老年人和有慢性基礎(chǔ)疾病者預(yù)后較差。根據(jù)WHO每日情況報告顯示，全世界的COVID-19死亡率約為6.4%，雖然SARS-CoV-2的致死率遠(yuǎn)低于SARS-CoV（10%～12%）和MERS（30%～34%）［16］，但是SARS-CoV-2的傳染性更高，因而更具致命性。

1.4 病毒抵抗力及滅活條件SARS-CoV-2在空氣中可存活3 h左右，在塑料和不銹鋼等物體表面存活長達(dá)2～3 d［17］。SARS-CoV-2對熱和紫外線較敏感，56℃30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒劑、過氧乙酸和氯仿等脂溶劑均可有效滅活病毒，氯己定不能有效滅活病毒［18］。

1.5 實驗室暴露風(fēng)險因素在BSL-3/ABSL-3實驗室開展SARS-CoV-2病毒相關(guān)實驗活動，實驗人員經(jīng)常會接觸到SARS-CoV-2活病毒，SARS-CoV-2感染動物的血液、組織、尿液、糞便等樣本，另外樣本在離心、勻漿等過程中也可能產(chǎn)生含有SARS-CoV-2的氣溶膠，極易導(dǎo)致實驗人員感染SARS-CoV-2。此外，實驗人員如果生物安全意識不強(qiáng)，未嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行實驗，也極易發(fā)生職業(yè)暴露。加之有些實驗室生物安全管理經(jīng)驗不足，缺乏預(yù)防SARS-CoV-2感染的安全管理措施和應(yīng)急預(yù)案，一旦發(fā)生生物安全事故，不能及時采取有效的應(yīng)對措施，將增加實驗人員感染SARS-CoV-2的風(fēng)險。

2 開展SARS-CoV-2相關(guān)實驗的風(fēng)險識別

2.1 SARS-CoV-2感染性樣本的包裝、運輸風(fēng)險識別（1）包裝材料選擇不當(dāng)，導(dǎo)致病毒泄漏；（2）內(nèi)層容器密封不嚴(yán)，導(dǎo)致病毒泄漏；（3）填充材料不能很好的保護(hù)內(nèi)容物；（4）運輸過程中因顛簸導(dǎo)致包裝物破損、樣品泄漏；（5）運輸過程中可能發(fā)生車禍、被盜、搶劫等意外，導(dǎo)致病毒泄露、擴(kuò)散。

2.2 操作SARS-CoV-2感染性樣本相關(guān)風(fēng)險識別

2.2.1 SARS-CoV-2感染性樣本接收風(fēng)險識別（1）毒種或樣本泄漏，造成實驗人員暴露；（2）低溫保護(hù)填充物失效，造成毒種或樣本泄漏失活。

2.2.2 SARS-CoV-2病毒或感染性樣本的分離與培養(yǎng)及保存風(fēng)險識別（1）樣品離心過程中離心管破裂導(dǎo)致病毒泄漏；（2）打開樣品管蓋、移液、稀釋、混勻等操作過程中產(chǎn)生氣溶膠；（3）離心感染性樣品后消毒不徹底。

2.2.3 病毒核酸提取風(fēng)險識別（1）提取核酸試劑盒中的Binding Buffer或Trizol等具有消毒作用的試劑，因作用濃度和作用時間不夠，導(dǎo)致病毒裂解不徹底；（2）將感染性材料滅活后轉(zhuǎn)移出BSL-3/ABSL-3實驗室時，因表面消毒不徹底導(dǎo)致環(huán)境污染或工作人員暴露。

2.2.4 SARS-CoV-2感染實驗動物飼養(yǎng)及實驗過程風(fēng)險識別（1）感染SARS-CoV-2的實驗動物逃逸；（2）抓取實驗動物時被SARS-CoV-2感染性實驗動物抓傷或咬傷；（3）麻醉、采血、解剖等實驗過程中，實驗人員因使用注射器、采血針、解剖器械等利器被刺傷或割傷導(dǎo)致感染；（4）動物剖檢過程中產(chǎn)生SARS-CoV-2感染性廢液、氣溶膠導(dǎo)致環(huán)境污染；（5）實驗人員疲勞操作，操作失誤幾率增大，增大SARS-CoV-2感染風(fēng)險；（6）將多聚甲醛固定但滅活不徹底的SARS-CoV-2感染性組織樣本帶出BSL-3/ABSL-3實驗室導(dǎo)致環(huán)境污染或?qū)嶒炄藛T暴露；（7）動物實驗過程中產(chǎn)生的廢棄物因包裝不密封或垃圾袋轉(zhuǎn)運至雙扉滅菌器過程中因外表面消毒不徹底導(dǎo)致SARS-CoV-2污染環(huán)境；（8）滅菌不徹底的動物尸體或其他廢棄物運出實驗室，導(dǎo)致SARS-CoV-2污染環(huán)境或工作人員暴露。

2.3 使用實驗儀器設(shè)備的風(fēng)險識別（1）離心機(jī)：離心SARS-CoV-2感染性樣品過程中離心管破裂導(dǎo)致SARS-CoV-2感染性樣品泄漏污染環(huán)境和人員暴露；（2）超低溫冰箱或液氮罐：保存SARS-CoV-2毒種的凍存管破裂或炸裂導(dǎo)致SARS-CoV-2泄露，造成環(huán)境污染或?qū)嶒炄藛T暴露；（3）Ⅱ級A2型生物安全柜：生物安全柜HEPA過濾膜失效導(dǎo)致含有SARS-CoV-2的氣溶膠泄漏污染環(huán)境或人員暴露；停電導(dǎo)致生物安全柜停止運行；生物安全柜負(fù)壓出現(xiàn)異常；生物安全柜使用后沒有消毒或消毒不徹底；生物安全柜內(nèi)SARS-CoV-2感染性樣品溢灑；（4）負(fù)壓動物飼養(yǎng)隔離器：隔離器故障、停電停機(jī)等導(dǎo)致負(fù)壓異常，SARS-CoV-2氣溶膠泄漏到實驗室外污染環(huán)境；籠具消毒滅菌不徹底傳出實驗室導(dǎo)致SARS-CoV-2泄漏污染環(huán)境等。

2.4 實驗后清場及廢棄物處理風(fēng)險識別（1）消毒劑失效導(dǎo)致消毒不徹底；（2）實驗人員未嚴(yán)格按標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序（Standard Operating Procedure，SOP）進(jìn)行操作，清場不徹底，導(dǎo)致SARS-CoV-2泄露；（3）廢棄物未正確分類并選擇相應(yīng)的滅菌程序進(jìn)行滅菌，滅菌不徹底，導(dǎo)致SARS-CoV-2泄露；（4）雙扉滅菌器異常，導(dǎo)致SARS-CoV-2泄露。

3 針對上述風(fēng)險采取的生物安全防護(hù)措施

3.1 SARS-CoV-2實驗期間人員防護(hù)措施

3.1.1 BSL-3實驗室人員防護(hù)要求穿一次性內(nèi)衣/內(nèi)褲，洗手衣，一次性帽子，襪子，N95口罩，一次性連體服，正壓頭罩，反穿衣，雙層手套（內(nèi)層為一次性深色丁腈手套，外層為一次性乳膠手套），防水中筒膠靴，一次性靴套。

3.1.2 ABSL-3實驗室人員防護(hù)要求穿一次性內(nèi)衣/內(nèi)褲，洗手衣，一次性帽子，襪子，N95口罩，一次性連體服，正壓頭罩，反穿衣，雙層手套（內(nèi)層為一次性深色丁腈手套，外層為一次性乳膠手套），防水中筒膠靴，一次性靴套。必要時穿戴防抓咬或防割傷手套。

3.1.3 個人防護(hù)用品的穿脫流程見圖1和圖2。

圖1 個人防護(hù)用品的穿戴流程

圖2 個人防護(hù)用品的脫卸流程

3.2 SARS-CoV-2感染性樣本的包裝、運輸防護(hù)措施

3.2.1 SARS-CoV-2感染性樣本的包裝按照《病原微生物實驗室生物安全管理條例》《國際航運協(xié)會危險品運輸管理規(guī)定》等相關(guān)法規(guī)，采取A類包裝，符合UN2814要求，應(yīng)按照三重包裝系統(tǒng)進(jìn)行包裝。

3.2.2 一律選用帶有螺旋蓋的凍存管、試管等保存SARS-CoV-2感染性樣本。

3.2.3 填充材料必須完全包裹內(nèi)層包裝；保證在任何姿態(tài)下內(nèi)層包裝均不會變形、破裂；保證在內(nèi)容物溢出的情況下可以完全吸附溢出液體；如同時包裝2個以上的內(nèi)容物，必須用填充物相互隔開。

3.2.4 隨樣品配備泄漏處理包應(yīng)包含足夠量的個人防護(hù)裝置和消毒劑，如發(fā)生泄漏，應(yīng)立即對泄漏物進(jìn)行處理，并清除泄漏區(qū)域的污染，處理過程中產(chǎn)生的垃圾必須先收集起來，經(jīng)高壓滅菌后再處理。

3.2.5 應(yīng)通過陸路專用車輛運輸SARS-CoV-2感染性樣本；應(yīng)事先與接收單位確定運送的時間和運輸方式，提前辦理運輸手續(xù)，并報送公安機(jī)關(guān)和屬地衛(wèi)生健康委員會，如發(fā)生突發(fā)情況，相關(guān)責(zé)任人應(yīng)按程序及時上報。

3.3 操作SARS-CoV-2感染性樣本的防護(hù)措施

3.3.1 所有直接接觸SARS-CoV-2（包括感染性樣本的打開、病毒分離、培養(yǎng)、滴定、中和實驗、病毒感染性樣本的核酸提取等）的操作均在Ⅱ級A2型生物安全柜中進(jìn)行。實驗開始前在生物安全柜臺面操作區(qū)鋪一層浸有消毒劑的吸水紙巾，一旦有感染性液體溢灑，立即用浸有消毒劑的吸水紙巾進(jìn)行擦拭消毒，并更換新的消毒紙巾。

3.3.2 核酸提取時，嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行，也可適當(dāng)增加試劑用量或延長作用時間，保證病毒充分滅活。

3.3.3 BSL-3實驗室內(nèi)均使用質(zhì)量合格的螺口管，涉及SARS-CoV-2感染性樣品離心時，均使用生物安全密封型離心機(jī)轉(zhuǎn)子或離心管套筒。所有SARS-CoV-2感染性樣品的裝卸均在生物安全柜中進(jìn)行，所有物品拿出生物安全柜前均用75%酒精進(jìn)行表面噴灑消毒。

3.3.4 從超低溫冰箱或液氮罐中取SARS-CoV-2毒種或其他SARS-CoV-2感染性樣品時，必須戴防凍手套，毒種或樣品取出后立即放于可密閉的容器內(nèi)再轉(zhuǎn)移至生物安全柜中，表面用75%酒精消毒后再打開樣品管。

3.3.5 生物安全柜使用完后，臺面用浸有75%酒精的吸水紙進(jìn)行擦拭消毒，廢棄物分類包裝并表面消毒后再拿出生物安全柜，然后開啟紫外殺菌燈，消毒時長至少30 min。

3.3.6 所有SARS-CoV-2感染的實驗動物飼養(yǎng)均在負(fù)壓動物隔離器中進(jìn)行，每天由經(jīng)過培訓(xùn)合格的實驗人員對實驗動物進(jìn)行飼養(yǎng)、觀察、廢棄物清理。

3.3.7 開展動物實驗前，先對SARS-CoV-2感染的動物進(jìn)行可靠麻醉，必要時戴防抓咬手套或借助工具。如抓取小鼠時，先用鑷子夾住小鼠尾部，再放入誘導(dǎo)麻醉盒中進(jìn)行麻醉；對實驗猴進(jìn)行麻醉前，先借助負(fù)壓隔離器上的保定裝置對實驗猴進(jìn)行保定后，再麻醉。

3.3.8 進(jìn)行動物實驗時，涉及注射器的使用，禁止將取下的針頭保護(hù)套再套回，使用過的針頭置于專用的利器盒中。進(jìn)行動物解剖實驗時，應(yīng)使用鈍頭手術(shù)剪，避免使用尖頭手術(shù)剪和刀片；實驗人員不要交叉左右手進(jìn)行操作；手術(shù)器械的擺放應(yīng)按一定方向，并根據(jù)實驗人員的操作習(xí)慣擺放。

3.3.9 提前安排好實驗時間，不得連續(xù)在ABSL-3實驗室內(nèi)工作超過4 h，避免疲勞操作。

3.3.1 0采取多聚甲醛固定的SARS-CoV-2感染性樣品時，單個樣品體積不能過大，并保證樣品完全浸泡在多聚甲醛中。室溫下，感染性樣品浸泡在多聚甲醛中至少7 d后才可轉(zhuǎn)出實驗室開展后續(xù)實驗，以保證SARS-CoV-2被完全滅活。

3.3.1 1每個實驗項目結(jié)束后，先用75%酒精對負(fù)壓動物隔離器內(nèi)外進(jìn)行噴灑消毒，再用紫外消毒裝置對環(huán)境進(jìn)行消毒，最后對負(fù)壓動物隔離器和實驗室環(huán)境進(jìn)行清場清潔，最后再次使用75%酒精對負(fù)壓動物隔離器內(nèi)外和環(huán)境進(jìn)行噴灑消毒，為開展下一個實驗項目做準(zhǔn)備。

3.4 關(guān)鍵儀器設(shè)備使用的防護(hù)措施

3.4.1 對所有實驗人員進(jìn)行儀器設(shè)備的操作培訓(xùn)，培訓(xùn)合格后方能使用該儀器；每種儀器設(shè)備旁均應(yīng)放置操作SOP，實驗人員必須嚴(yán)格按照SOP進(jìn)行操作，一旦儀器出現(xiàn)故障需聯(lián)系專人進(jìn)行處理。

3.4.2 所有設(shè)備由設(shè)備管理員進(jìn)行定期清潔、維護(hù)和保養(yǎng)。

3.4.3 建立應(yīng)急事故處理流程并對相關(guān)人員進(jìn)行培訓(xùn)，如離心機(jī)運行過程中懷疑發(fā)生離心管破碎，應(yīng)第一時間關(guān)閉離心機(jī)電源，靜置30 min后再將離心機(jī)轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)移至生物安全柜進(jìn)行處理。

3.4.4 BSL-3/ABSL-3實驗室的所有關(guān)鍵儀器設(shè)備均與不間斷電源（Uninterruptible power system，UPS）相連，避免停電造成意外事故的發(fā)生。

1.1 對象 2010年9月—2011年12月抽取社區(qū)脊髓損傷神經(jīng)源性膀胱功能障礙者76例，其中男39例，女37例，年齡19～74歲，平均年齡(45.7±3.3)歲;脊髓損傷部位:頸椎14例，胸椎39例，腰椎23例;損傷程度:完全性損傷18例，不完全性損傷58例;文化程度:小學(xué)以下1例，初高中61例，大學(xué)以上14例;經(jīng)濟(jì)收入:1 000元以下38例，1 000～2 000元31例，2 000元以上 7例;病程 1～39年，平均(10.5±2.5)年。

3.5 實驗后清場消毒及廢棄物處理的防護(hù)措施

3.5.1 實驗室常用的消毒劑為75%酒精和0.55%次氯酸鈉溶液，消毒劑由專人進(jìn)行配置，現(xiàn)用現(xiàn)配，24 h內(nèi)使用。

3.5.2 每次實驗結(jié)束后，用75%酒精浸泡的吸水紙巾擦拭工作臺面（包括生物安全柜、實驗臺等）及使用過的設(shè)備表面。

3.5.3 對實驗過程中產(chǎn)生的可能帶有感染性的廢棄物及污染材料進(jìn)行分類包裝，實驗產(chǎn)生的廢棄物分為固體廢棄物、液體廢棄物、利器、動物尸體等，利器放入專用利器盒中，再用生物安全垃圾袋進(jìn)行包裝，其余廢棄物全用生物安全垃圾袋進(jìn)行包裝。

3.5.5 為保證廢棄物可靠滅菌，每月定期對雙扉滅菌器進(jìn)行滅菌性能驗證，保證所有感染性物質(zhì)可靠滅菌后才傳出實驗室。

3.5.6 對需要傳出實驗室但不能高壓滅菌的實驗樣品（如提取的RNA）或?qū)嶒瀮x器等，采取75%酒精表面噴灑消毒后，經(jīng)傳遞窗紫外消毒30 min（不能經(jīng)紫外照射的實驗樣品，可用不透光的容器進(jìn)行包裝）的方式傳出實驗室。

3.5.7 BSL-3/ABSL-3實驗室定期（每月1次）進(jìn)行預(yù)防性消毒，實驗室臺面、儀器表面用噴有75%酒精的吸水紙進(jìn)行表面擦拭消毒；實驗室地面用浸有75%酒精的一次性拖布進(jìn)行擦拭消毒，使用過的吸水紙、一次性拖布按感染性廢棄物處理。

4 小結(jié)

新型冠狀病毒傳染性高，易造成職業(yè)暴露感染，給BSL-3/ABSL-3實驗室的生物安全帶來了巨大的挑戰(zhàn)，采取切實有效的生物安全防護(hù)措施可防止實驗人員感染或環(huán)境污染。本實驗室自開展SARS-CoV-2實驗以來，嚴(yán)格按照生物安全防護(hù)要求同時結(jié)合SARS-CoV-2的微生物學(xué)特性，采取有針對性的防護(hù)措施，同時實驗人員嚴(yán)格按照管理要求執(zhí)行，至今未發(fā)生實驗人員感染或環(huán)境污染事件，可為其他開展SARS-CoV-2實驗的實驗室生物安全防護(hù)工作提供參考。