郭闐廷，石 錦，戴 鵬，熊麗嬌，莫建文

（1.贛南醫(yī)學(xué)院2018級碩士研究生；2.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科；3.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院VIP科，江西 贛州 341000）

深靜脈血栓（Deep venous thrombosis，DVT）常發(fā)生在下肢深靜脈中，常見于股深靜脈、髂靜脈等。深靜脈血栓栓塞（Venous thromboembolism，VTE）是造成全球殘疾和死亡的主要原因之一，發(fā)病率約為12/10萬［1］，為最常見的急性心血管綜合征之一，隨著人口老齡化加劇發(fā)病率持續(xù)增高。DVT最嚴(yán)重的并發(fā)癥是栓子隨血流進(jìn)入肺動脈，造成肺動脈栓塞（Pulmonary embolism，PE）。傳統(tǒng)上認(rèn)為DVT的形成是由血液瘀滯、血管內(nèi)皮功能障礙和血液高凝性引起的。目前研究顯示DVT也與炎癥過程密切相關(guān)［2］。但DVT形成的炎癥相關(guān)機(jī)制尚未全面闡明，探索特異性治療靶點仍需進(jìn)一步探索。

白細(xì)胞介素-6（Interleukin 6，IL-6）是一種主要由炎癥細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子，它具有白細(xì)胞趨化作用等復(fù)雜的生物學(xué)功能［3］，IL-6在炎癥的發(fā)生和發(fā)展中具有重要的作用。

凝血過程是復(fù)雜的多因素綜合作用的結(jié)果［4］，其中炎癥在血栓的形成中具有重要的意義，但抑制IL-6能否影響深靜脈血栓形成尚未明確。本研究對創(chuàng)傷性深靜脈血栓模型動物進(jìn)行IL-6基因干擾。將IL-6基因干擾模型動物血栓形成情況與應(yīng)用經(jīng)典抗凝血藥物低分子肝素鈣的模型動物血栓形成情況進(jìn)行對比研究，為IL-6與深靜脈血栓形成之間的關(guān)系提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物及分組SPF級SD大鼠（雄性，200～250 g）30只，由贛南醫(yī)學(xué)院動物中心提供，飼養(yǎng)于贛南醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，飼養(yǎng)環(huán)境：室溫20℃～25℃，濕度50%～60%，常規(guī)光照，通風(fēng)良好，自由飲水、進(jìn)食；實驗前均適應(yīng)性喂養(yǎng)3～5 d。實驗過程中對動物的處置符合2006科技部《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定，所有動物實驗均經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)。隨機(jī)分為5組：AA組（si-RNA組）、BB組（model組）、CC組（507 si-RNA病毒組）、DD組［低分子肝素組（LMWH組）］、EE組［正常對照組（control組）］，每組6只。

1.1.2 試劑及儀器1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）、胎牛血清（Gibco公司，美國）、Lipo 3000轉(zhuǎn)染試劑（Thermo Fisher，美國）、Opti-MEM Gibco siRNA干擾套餐（3條特異性IL-6 siRNA陰性對照、陽性對照、FAM-siRNA）（上海生工生物工程有限公司，中國）、TRNzolTM Reagent（Thermo Fisher，美國）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，日本）、實時熒光定量試劑盒（Takara，日本）、上下游引物（上海生工生物有限公司，中國）、PCR儀BIOMETRA T1-96（Thermo Fisher，美國）、實時熒光定量PCR儀Bio-Rad CFX Connect Real-Time System（Thermo Fisher，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組常規(guī)培養(yǎng)大鼠大隱靜脈細(xì)胞：細(xì)胞購置于中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。收到細(xì)胞后于37℃5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置6～8 h后進(jìn)行換液，采用1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基＋10%胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）＋1%雙抗（青霉素＋鏈霉素）培養(yǎng)，細(xì)胞覆蓋率至80%～90%進(jìn)行傳代。細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定后應(yīng)用于實驗。

細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染效率研究：將大鼠大隱靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分為6組：A（184-si-RNA）、B（424-si-RNA）、C（507-si-RNA）、D（陰性基因?qū)φ眨?、E（單純轉(zhuǎn)染試劑）、F（空白對照）。常規(guī)培養(yǎng)的大鼠大隱靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞覆蓋皿底約70%時，按照分組A、B、C、D組加入相應(yīng)基因型lipo3000-siRNA混合液，E組細(xì)胞單純加入lipo3000轉(zhuǎn)染試劑，F(xiàn)組細(xì)胞正常培養(yǎng)不進(jìn)行特殊處理僅加入相應(yīng)體積的生理鹽水。按試劑盒要求進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作并應(yīng)用ELISA法篩選轉(zhuǎn)染抑制IL-6效率最高的si-RNA進(jìn)行下一步研究。

1.2.2 IL-6干擾效率檢驗

1.2.2.1 RT-PCR法檢測IL-6干擾效率使用PrimeScriptTM試劑盒提取血管內(nèi)皮細(xì)胞株總RNA。根據(jù)試劑盒使用說明書，使用cDNA合成試劑盒，合成第一鏈cDNA。采用Bio-Rad CFX Connect Real-Time System熒光定量PCR儀進(jìn)行實時PCR檢測IL-6 mRNA表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參（引物序列見表1）。使用比較循環(huán)閾值（Ct）計算基因的相對表達(dá)（2－△△Ct），實驗重復(fù)3次。

表1 引物序列

1.2.2.2 ELISA法檢測IL-6干擾效率將轉(zhuǎn)染的大鼠內(nèi)皮細(xì)胞按分組，取上清，低速冷凍離心3 000 rpm 5 min，并用大鼠IL-6 ELISA試劑盒，按照操作說明書進(jìn)行操作，各個孔中加入終止反應(yīng)液50μL使其終止反應(yīng)，后將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中讀取各孔OD值，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各孔濃度。統(tǒng)計后依據(jù)統(tǒng)計結(jié)果選擇合適的si-RNA。

1.2.3 動物轉(zhuǎn)染及建模隨機(jī)數(shù)字法進(jìn)行分組：分別為AA（正常對照組）；BB（模型組）；CC（模型＋si-RNA）；DD（模型＋低分子肝素鈣LMWH）；EE（模型＋空RNA載體組），每組6只。按分組要求于CC組經(jīng)尾靜脈注射1 mL的siRNA，EE組經(jīng)尾靜脈注射1 mL的RNA空載體，注射后3只1籠，飼養(yǎng)4周；4周后，除正常對照組外均采用定量鈍性打擊裝置造模：采用3℅戊巴比妥鈉溶液，按1 mg·kg-1劑量靜脈注射麻醉大鼠。麻醉起效后采取創(chuàng)傷定量打擊裝置，瞬間打擊能量為5 J［5］，分別擊打大鼠雙側(cè)大腿近端外側(cè)各1次（大轉(zhuǎn)子至大轉(zhuǎn)子下1 cm）。經(jīng)骨擦感或反?；顒幼C實造成股骨骨折后。于雙側(cè)大腿近端內(nèi)側(cè)股靜脈走行區(qū)的表面石膏固定［6］，局部開窗以便觀察血栓的形成情況。造模后實驗大鼠自由進(jìn)食、飲水，不用止血劑及抗生素。DD組（低分子肝素組）造模后每天注射等量的低分子肝素鈣［410 IU·（kg·d）-1］，120 h后所有實驗動物包括正常對照組統(tǒng)一取材。

1.2.4 深靜脈血栓發(fā)生率3%戊巴比妥鈉麻醉后將模型動物處死，將取材后的大鼠深靜脈進(jìn)行大體測量產(chǎn)生深靜脈血栓例數(shù)。

1.2.5 ELISA法檢測各組大鼠血清中IL-6的表達(dá)麻醉成功后，將大鼠按分組抽取下腔靜脈中血液常溫靜置5 min后，低速冷凍離心3 000 rpm 5 min，并用大鼠IL-6 ELISA試劑盒，按照操作說明書進(jìn)行操作，各個孔中加入終止反應(yīng)液50μL使其終止反應(yīng)，后將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中讀取各孔OD值，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各孔濃度。

1.2.6 RT-PCR檢測各組大鼠深靜脈組織IL-6 mRNA的表達(dá)麻醉成功后將大鼠下肢深靜脈剝離，去除血栓后用1×PBS溶液清洗3次，充分剪碎、勻漿。使用PrimeScriptTM試劑盒提取血管內(nèi)皮細(xì)胞株總RNA。根據(jù)試劑盒使用說明書，使用cDNA合成試劑盒，合成第一鏈cDNA，采用Bio-Rad CFX Connect Real-Time System熒光定量PCR儀進(jìn)行實時PCR檢測IL-6 mRNA表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參（引物序列同表1）。使用比較循環(huán)閾值（Ct）計算基因的相對表達(dá)（2－△△Ct），實驗重復(fù)3次。

1.2.7 Western Blot檢測各組大鼠深靜脈組織IL-6蛋白的表達(dá)收集各組大鼠深靜脈（去除血栓）標(biāo)本充分剪碎后添加含PMSF（sigma公司）的RIPA裂解液（Beyotime），冰浴30 min；4℃12 000 r·min-1離心5 min；取上清液，用BAC法測定計算總蛋白濃度。應(yīng)用蛋白免疫印跡法（Western Blot法）分析目標(biāo)蛋白的表達(dá)，應(yīng)用BIO-RAD膜成像系統(tǒng)顯色成像并用Quantilty One軟件進(jìn)行對比分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)采用Prism 8.0軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)以±s表示，組間各測定指標(biāo)比較采用單因素方差分析，組內(nèi)各指標(biāo)的多重比較采用SNK檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染si-RNA對血管內(nèi)皮細(xì)胞IL-6 mRNA表達(dá)的影響RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中IL-6 mRNA相對表達(dá)情況，共分為184 IL-6 si-RNA組、424 IL-6 siRNA組、507 IL-6 si-RNA組、陰性對照組、單純轉(zhuǎn)染試劑組和空白對照組。結(jié)果顯示：與空白對照組相比，單純轉(zhuǎn)染試劑組、陰性對照組IL-6 mRNA表達(dá)均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；507 IL-6 si-RNA組IL-6 mRNA表達(dá)最低，且與424 IL-6 siRNA組、陰性對照組和空白對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖1）。

圖1 各組大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞IL-6 mRNA的表達(dá)

2.2 Elisa法檢測si-RNA轉(zhuǎn)染對大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞上清液中IL-6表達(dá)的影響Elisa法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液中IL-6表達(dá)情況，共分為184 IL-6 si-RNA組、424 IL-6 siRNA組、507 IL-6 si-RNA組、陰性對照組、單純轉(zhuǎn)染試劑組和空白對照組。結(jié)果顯示：與空白對照組相比，單純轉(zhuǎn)染試劑組、陰性對照組上清液IL-6表達(dá)均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；507 IL-6 si-RNA組上清液IL-6表達(dá)最低，且與184 IL-6 si-RNA組、424 IL-6 siRNA組和空白對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。

圖2 各組大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞上清液中IL-6的表達(dá)

2.3 免疫熒光驗證轉(zhuǎn)染效率免疫熒光法觀察驗證507 si-RNA通過載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入實驗大鼠靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（圖3）。

圖3 免疫熒光驗證轉(zhuǎn)染效率

2.4 實驗動物產(chǎn)生深靜脈血栓數(shù)量sham組未形成血栓；model組3只出現(xiàn)血栓，血栓形成率為50%；model+si-RNA組2只形成血栓，血栓形成率33.3%；model+LMWH組3只形成血栓，血栓形成率為50%；model+空載體組4只形成血栓，血栓形成率為66.6%（圖4）。

圖4 各組深靜脈血栓形成率

2.5 病毒轉(zhuǎn)染對大鼠血清IL-6表達(dá)的影響與sham組相比，model組血清IL-6水平明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與model組相比，model＋si-RNA組血清IL-6水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與model＋si-RNA組相比，model＋LMWH組血清IL-6水平增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖5）。

圖5 各組大鼠血清IL-6的表達(dá)

2.6 病毒轉(zhuǎn)染對大鼠深靜脈組織IL-6 mRNA表達(dá)的影響與sham組相比，model組IL-6 mRNA水平明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與model組相比，model＋si-RNA組IL-6 mRNA水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與model＋si-RNA組相比，model＋LMWH組IL-6 mRNA水平增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖6）。

圖6 各組大鼠深靜脈組織IL-6 mRNA的表達(dá)

2.7 病毒轉(zhuǎn)染對大鼠深靜脈組織IL-6蛋白含量的影響與sham組相比，model組IL-6蛋白表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與model組相比，model＋si-RNA組IL-6蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與model＋si-RNA組相比，model＋LMWH組IL-6蛋白表達(dá)水平增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖7）。

圖7 各組大鼠深靜脈組織IL-6蛋白含量

3 討論

深靜脈血栓是一種嚴(yán)重影響人類健康的疾病，它具有發(fā)病率高、后果嚴(yán)重的特點。隨著老齡化的加劇，深靜脈血栓的發(fā)病率也呈逐步增高的趨勢。研究表明深靜脈血栓形成與炎癥具有密切的關(guān)系［2］。炎癥因子種類繁多，白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）是由B細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、活化的T細(xì)胞產(chǎn)生，通過旁分泌、自分泌和內(nèi)分泌方式發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的一種細(xì)胞因子［7］。它具有多種生物學(xué)功能，可以刺激炎癥細(xì)胞進(jìn)行趨化并刺激中性粒細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等釋放炎癥因子進(jìn)一步促進(jìn)炎癥反應(yīng)。

siRNA是指將雙鏈RNA進(jìn)入細(xì)胞后，發(fā)生降解與mRNA特異性結(jié)合，導(dǎo)致mRNA的沉默從而不表達(dá)目的蛋白［8］，其在轉(zhuǎn)錄水平上抑制基因的表達(dá)。siRNA為雙鏈RNA，長度較短，主要介導(dǎo)短期的RNA干擾，干預(yù)特定蛋白的表達(dá)。我們通過向血管內(nèi)皮細(xì)胞中定向?qū)?07-siRNA靶向干擾大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞IL-6的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。在實驗中我們觀察到，創(chuàng)傷性深靜脈血栓模型動物中IL-6基因的轉(zhuǎn)錄和IL-6蛋白的表達(dá)均增加，同時提示IL-6是深靜脈血栓形成中一個重要的分子，血管內(nèi)皮細(xì)胞在受到炎癥、創(chuàng)傷、缺血缺氧等刺激后，會激活相應(yīng)的細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路，使IL-6釋放增加。IL-6是重要的白細(xì)胞趨化因子，可以刺激單核巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞局部聚集。同時單核巨噬細(xì)胞及受損的內(nèi)皮細(xì)胞釋放大量的腫瘤壞死因子（TNF-α）及IL-1，升高的TNF-α及IL-1一方面刺激單核細(xì)胞釋放大量的組織因子（TF）［9-10］，另一方面與血小板上的Toll樣受體（TLR）結(jié)合，激活NF-κB信號通路，導(dǎo)致IL-6的大量釋放［11］。同時NF-κB信號通路的激活又進(jìn)一步促進(jìn)TNF-α及IL-1的表達(dá)，這就形成了炎癥反應(yīng)信號初期的“瀑布效應(yīng)”［12］。大量釋放的IL-6能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞的成熟，改變血小板活性，增加其促凝活性；同時能夠誘導(dǎo)肝臟產(chǎn)生如C-反應(yīng)蛋白、纖維蛋白原等這些急性反應(yīng)蛋白，增加凝血因子的數(shù)量［13］；IL-6還可以促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)組織間黏附因子（Intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1），ICAM-1能夠增強(qiáng)中性粒細(xì)胞黏附作用，能夠促進(jìn)中性粒細(xì)胞釋放氧自由基，加重內(nèi)皮細(xì)胞損傷促進(jìn)血栓形成［14］。在實驗中我們觀察到當(dāng)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞IL-6產(chǎn)生時實驗動物血栓形成的數(shù)量較模型組明顯減少，并伴隨著血清中IL-6含量降低。綜合實驗結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)我們可以推論IL-6是深靜脈血栓形成過程中重要的一個因子，血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放IL-6的含量與血栓形成呈正相關(guān)，且通過對血清IL-6含量的測定可以早期預(yù)測深靜脈血栓的發(fā)生風(fēng)險。

低分子肝素鈣（LMWH）是臨床常用的一種抗凝藥物，其作用機(jī)制主要是通過抑制凝血因子Xa、白細(xì)胞促凝酶、單核細(xì)胞促凝因子等釋放，特異性地阻斷Xa與G蛋白偶連的蛋白酶激活受體3（PAR3），發(fā)揮抗炎作用。同時，LMWH還可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞合成并釋放組織因子途徑抑制因子（TFPI），通過刺激血管內(nèi)皮釋放纖溶酶原激活物，增強(qiáng)纖維蛋白溶解，減弱纖維蛋白原對紅細(xì)胞、血小板的聚集橋聯(lián)作用，從而抑制血液有形成分的聚集，減少血液高凝和高黏滯狀態(tài)，并通過抑制凝血酶的作用來抑制內(nèi)源性和外源性凝血機(jī)制［15］。有研究發(fā)現(xiàn)給小鼠注射5 000 U·kg-1低分子肝素能抑制TNF-α誘發(fā)的白細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞上的滾動、黏附和組織浸潤［16］。低分子肝素可能通過下調(diào)炎癥介質(zhì)IL-6、TNF-α的表達(dá)而實現(xiàn)抗炎作用［17］，并很可能通過干擾炎癥細(xì)胞的組織浸潤而抑制TNF-α誘發(fā)的白細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞上的滾動、黏附和組織浸潤，起到有效的抗炎作用［16］。在實驗中我們也觀察到了低分子肝素鈣組的模型動物產(chǎn)生的IL-6較模型組降低，該結(jié)果提示低分子肝素很可能通過多種作用機(jī)制起到抗炎作用，且IL-6是其發(fā)揮抗凝作用中重要的分子。

目前認(rèn)為IL-6參與血栓形成的機(jī)制可能有三種：⑴IL-6能夠激活血小板，增加其促凝活性，促進(jìn)血栓的形成；⑵IL-6能夠誘導(dǎo)肝臟產(chǎn)生如C-反應(yīng)蛋白、纖維蛋白原等急性反應(yīng)蛋白，增加凝血因子的數(shù)量，最終在血栓形成過程中起促進(jìn)作用；⑶IL-6還可以促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)ICAM-1，ICAM-1能夠增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞黏附作用，促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞釋放氧自由基，加重細(xì)胞損傷。研究表明，在大鼠創(chuàng)傷深靜脈血栓模型中模型組IL-6水平較正常組升高，血栓形成率增高，當(dāng)應(yīng)用si-RNA抑制IL-6表達(dá)水平的降低，能夠降低血小板聚集，從而抑制了血栓形成［18］；也有研究證明，阻斷IL-6受體可大大減少血栓形成和小鼠炎癥細(xì)胞募集，同時臨床樣本證明了IL-6還會使血小板與膠原受體相互作用，從而增加血小板聚集并引起血栓形成的傾向［19］。另一方面，IL-6的升高，經(jīng)IL-6途徑作用于肝臟，誘導(dǎo)肝臟釋放急性期蛋白如C反應(yīng)蛋白、纖維蛋白原和纖溶酶原等［20］，導(dǎo)致血液內(nèi)凝血因子增多，加速血栓形成。最后，IL-6能夠上調(diào)ICAM-1，募集白細(xì)胞和誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞遷移和增殖［21］，導(dǎo)致局部細(xì)胞增多，使得血液處于高凝狀態(tài)，同時，ICAM-1能夠促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞釋放氧自由基，加重局部細(xì)胞的損傷，進(jìn)一步導(dǎo)致炎癥因子的釋放。

研究通過建立創(chuàng)傷性深靜脈血栓動物模型，發(fā)現(xiàn)IL-6是深靜脈血栓形成過程中一個重要的中間分子。并通過ICAM-1等分子調(diào)節(jié)局部炎癥因子，影響局部炎癥。使用si-RNA干擾IL-6的合成能有效減低創(chuàng)傷性深靜脈血栓動物模型血栓生成率。低分子肝素鈣主要是通過抑制凝血因子Xa產(chǎn)生抗凝作用，對比使用低分子肝素鈣組動物的IL-6含量變化，我們推測抑制內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，減低IL-6是低分子肝素鈣可能的抗凝作用機(jī)制之一。實驗結(jié)果我們推測IL-6含量與深靜脈血栓形成正相關(guān)，觀察血清IL-6含量的變化可能對深靜脈血栓形成具有預(yù)測作用。