尹 陽(yáng)，孫巨軍，李 越，李 欣，何 謙

（1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安 710004；2.西電集團(tuán)醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安 710077）

乳腺癌（breast cancer）是女性發(fā)病率最高的癌癥，占女性新患腫瘤的30%[1]。治療乳腺癌成功的關(guān)鍵很大程度上在于患者確診時(shí)疾病的分期情況[2]，因此，及早發(fā)現(xiàn)乳腺癌是乳腺癌治療的關(guān)鍵因素。找尋能夠早期發(fā)現(xiàn)乳腺癌的標(biāo)志物是目前乳腺癌診治中的一個(gè)重大挑戰(zhàn)。

miRNA 是一類(lèi)在轉(zhuǎn)錄后水平起調(diào)控作用的基因家族，長(zhǎng)度約21 個(gè)核苷酸，在生物進(jìn)化過(guò)程中不易發(fā)生改變，其廣泛存在于真核生物中，它們?cè)诟鞣N生理和發(fā)育過(guò)程中控制基因的表達(dá)，因此在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用[3]。miRNA 與人類(lèi)各種疾病的聯(lián)系是近幾年來(lái)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)，多種miRNA 的突變或表達(dá)異?？赡芘c癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，已發(fā)現(xiàn)有力的證據(jù)表明miRNA可以用于癌癥的診斷、分期及預(yù)后[4]。近幾年來(lái)很多研究將miRNA 作為原發(fā)性乳腺癌診斷標(biāo)志物，并顯示出良好的臨床前景。與單個(gè)miRNA 相比，聯(lián)合多個(gè)miRNA 顯示出更好的診斷性能，本文擬通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)，篩選出合適的miRNA 用于早期診斷。

1 材料與方法

1.1 資料來(lái)源 從腫瘤基因組圖譜TCGA（http://cancergenome.nih.gov/）中獲取原發(fā)性乳腺癌組織和正常乳腺組織的miRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)。使用miRwalk 2.0（http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/）軟件預(yù)測(cè)miRNA 可能作用的基因，使用c-Bioportal（http://www.cbioportal.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)篩選乳腺癌高頻突變基因。

1.2 方法

1.2.1 差異表達(dá)miRNA 篩選：使用TCGA biolinks R 包下載TCGA-BRCA miRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)。使用Deseq2 R 包對(duì)TCGA-BRCA miRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異篩選，篩選條件為L(zhǎng)ogFC（foldchange）大于3，P＜ 0.05。并使用ggplot2 R 包繪制火山圖。

1.2.2 靶基因預(yù)測(cè)：使用miRwalk 2.0 軟件預(yù)測(cè)差異miRNA 的可能作用的基因即靶基因。

1.2.3 高頻突變基因篩選：使用c-Bioportal 數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)置發(fā)生率閾值為5%，篩選高頻突變基因。

1.2.4 ROC 曲線分析：使用pROC 包對(duì)下載TCGA-BRCA miRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行ROC 分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用Deseq2 R 包、pROC 包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。ROC 曲線用于評(píng)價(jià)診斷效能，計(jì)算曲線下面積(AUC)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌差異miRNA 的篩選 在TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)下載包含原發(fā)性乳腺癌組織1 075 例，正常對(duì)照乳腺組織95 例，共有1 870 條miRNA 的表達(dá)數(shù)據(jù)。共找到差異表達(dá)顯著miRNA 129 個(gè)，上調(diào)miRNA 90 個(gè)，下調(diào)miRNA 39 個(gè)，見(jiàn)表1。并繪制火山圖，見(jiàn)圖1。篩選出了前20 名差異表達(dá)的miRNA，按排名先后依次是：hsa-miR-105-2，hsa-miR-1269a，hsa-miR-767，hsa-miR-105-1，hsa-miR-449a，hsa-miR-1269b，hsa-miR-184，hsa-miR-592，hsamiR-4724，hsa-miR-449b，hsa-miR-486， hsamiR-4501，hsa-miR-449c，hsa-miR-4732，hsamiR-210，hsa-miR-187，hsa-miR-190b， hsamiR-96，hsa-miR-196a-1 和hsa-miR-7705。

表1 差異表達(dá)的miRNA 結(jié)果

圖1 差異表達(dá)miRNA 的火山圖

2.2 篩選用于乳腺癌診斷的目標(biāo)miRNA 預(yù)測(cè)129 個(gè)差異miRNA 的可能作用的基因即靶基因，結(jié)果預(yù)測(cè)到18 413 個(gè)靶基因。在17 897 個(gè)發(fā)生突變的基因中突變發(fā)生率大于5%的基因12 個(gè)，見(jiàn)表2。18 413 個(gè)靶基因中包含12 個(gè)高頻基因，所以說(shuō)這12 個(gè)基因?yàn)椴町恗iRNA 的靶基因，同時(shí)也是高頻基因，這些基因能被63 個(gè)miRNA 作用，見(jiàn)表3。將乳腺癌前20 名差異表達(dá)的miRNA 與這63 個(gè)作用于高頻突變的靶基因的miRNA 求交集，得到6 個(gè)目標(biāo)miRNA，他們是hsa-miR-592，hsamiR-486，hsa-miR-4732，hsa-miR-196a，hsa-miR-449b 和hsa-miR-187。

表2 突變發(fā)生率大于5%的基因結(jié)果

表3 作用于12 個(gè)高頻靶基因的miRNA 結(jié)果

2.3 目標(biāo)miRNA 的ROC 曲線分析 對(duì)上述篩選得到的6 個(gè)miRNA 進(jìn)行ROC 曲線分析（見(jiàn)圖2），各 miRNA 的ROC 曲線下AUC 面積越大，其作為腫瘤標(biāo)志物的診斷能力越強(qiáng)。其中hsa-miR-592 ROC 曲線下AUC 面積為0.950 ，hsa-mir-486 為0.938，說(shuō)明其作為腫瘤標(biāo)志物的診斷能力良好。

圖2 目標(biāo)miRNA 的ROC 曲線

3 討論

由于乳腺癌的早期診斷對(duì)于患者預(yù)后至關(guān)重要，并且現(xiàn)在臨床常用的診斷方法顯示出某些局限性，miRNA 逐漸成為乳腺癌的新型診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物。但是回顧當(dāng)前的研究成果，觀察到不同研究小組確定的miRNA 幾乎沒(méi)有一致性，因此尚無(wú)可用于臨床診斷的miRNA，原因可能是由于患者選擇的差異，用于分離和檢測(cè)miRNA 的技術(shù)限制，樣本量不足，統(tǒng)計(jì)分析不足以及測(cè)試其臨床效果的驗(yàn)證研究數(shù)量不足等[5]。TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)提供了代表30 多種不同癌癥的超過(guò)11 000 個(gè)個(gè)體的基因組序列、表達(dá)、甲基化和拷貝數(shù)變異數(shù)據(jù)[6]，是迄今最成功的癌癥基因組學(xué)項(xiàng)目之一。本研究中我們利用TCGA 公開(kāi)數(shù)據(jù)篩選原發(fā)性乳腺癌相關(guān)miRNA，該方法基于大樣本大數(shù)據(jù)，避免樣本量不足，弱化了個(gè)體差異，與用少量乳腺患者樣本或乳腺癌細(xì)胞系進(jìn)行miRNA 篩選相比將更加準(zhǔn)確和高效。

在miRNA 對(duì)原發(fā)性乳腺癌早期診斷價(jià)值的研究中，篩選敏感度特異度好的miRNA 作為血清學(xué)診斷標(biāo)志物尤為關(guān)鍵。為了讓篩選的miRNA 與原發(fā)性乳腺癌有更強(qiáng)的相關(guān)性，在篩選條件中首先要求miRNA 在乳腺癌組織中表達(dá)水平較正常乳腺組織變化3 倍以上，其次符合條件的至少與一個(gè)原發(fā)性乳腺癌突變基因發(fā)生相互作用，并且這種相互作用需要強(qiáng)力的證據(jù)支持[7]。為此，在利用TCGA 數(shù)據(jù)得到差異表達(dá)的miRNA 后，我們進(jìn)一步在 miRNA 靶基因預(yù)測(cè)工具上大范圍尋找差異表達(dá)miRNA 可能作用的靶基因，并將靶基因與原發(fā)性乳腺癌高頻突變基因進(jìn)行比較，有交集者所對(duì)應(yīng)的miRNA 列為重點(diǎn)考慮miRNA，以此找到與原發(fā)性乳腺癌有強(qiáng)相關(guān)性的miRNA。最近的研究表明，基于多個(gè)miRNA 的聯(lián)合分析比單個(gè)miRNA 分析具有更好的診斷性能[8]，因?yàn)槎鄠€(gè)miRNA 控制多個(gè)靶基因，能夠更好地闡明它們是如何促進(jìn)腫瘤發(fā)展、逐步調(diào)控腫瘤進(jìn)程的生物學(xué)效應(yīng)[9]。也有研究者將miRNA 和臨床上已廣泛使用的腫瘤標(biāo)志物血清CEA，CA125 和CA153聯(lián)合用于診斷乳腺癌，以提高診斷敏感度和特異度[10]。綜合考慮實(shí)驗(yàn)可操作性和臨床應(yīng)用的經(jīng)濟(jì)性，診斷模型中聯(lián)合四五種miRNA 建立原發(fā)性乳腺癌診斷模型較為理想[11]。本文利用生物信息學(xué)方法篩選miRNA 進(jìn)行后續(xù)原發(fā)性乳腺癌的診斷研究，方法簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、可信度高，值得參考。