葉嬋娟

（揚(yáng)州市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，江蘇225009）

黃體酮軟膠囊屬于孕激素類藥物，可用于治療由黃體酮缺乏引起的機(jī)能障礙、排卵功能障礙引發(fā)的月經(jīng)失調(diào)、痛經(jīng)及經(jīng)前期綜合征、出血、絕經(jīng)前紊亂、絕經(jīng)，也有助于妊娠［1-2］。黃體酮的含量測定方法已經(jīng)成熟，但是由于劑型的影響，軟膠囊劑在試驗(yàn)過程中的操作誤差較其他制劑來說會更大。本文就HPLC法測定黃體酮軟膠囊含量進(jìn)行不確定度分析，以驗(yàn)證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，保證測量結(jié)果可靠性。

對樣品進(jìn)行準(zhǔn)確的表征是進(jìn)行測量的目的，但是測量值與真值之間必然存在一定的差異，這種差異來源于測量誤差，而測量誤差不可避免地存在于試驗(yàn)的方方面面。由于誤差存在的必然性，而檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)出具報告的準(zhǔn)確性又是一個機(jī)構(gòu)的生命線，因此作為一個檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)，測量的準(zhǔn)確性評價就顯得尤為重要。測量不確定度是“表征合理地賦予被測量值的分散性，與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)”，其可以在一定程度內(nèi)對被測量客觀值進(jìn)行評定，對測量結(jié)果的質(zhì)量及水平進(jìn)行定量表征。在試驗(yàn)中測量不確定度越小，測量結(jié)果質(zhì)量越高，其使用價值越大［3-4］。

本文參考《測量不確定度評定與表示》中相關(guān)規(guī)定，并根據(jù)《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》，利用日常檢驗(yàn)過程中HPLC法測定黃體酮軟膠囊的含量數(shù)據(jù)進(jìn)行不確定度分析，以期找出影響不確定度的各類因素，并對不確定度進(jìn)行評估，為檢驗(yàn)檢測報告的合理評價提供可靠依據(jù)，也為HPLC法測定其他樣品進(jìn)行指導(dǎo)，降低不確定度，提高測量結(jié)果質(zhì)量。

1 測定方法及不確定來源

1.1 儀器與試藥 日本島津LC-20AD高效液相色譜儀，SPD-10A紫外檢測器，LC Solution化學(xué)工作站，瑞士Mettler公司XS205DU型電子分析天平；Milli-Q IQ7000超純水機(jī)，KH-400KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器。黃體酮對照品（中國藥品生物制品檢定研究院，批號100027-201810，供鑒別及含量測定用，105℃干燥3 h后使用，含量：99.6%）；黃體酮軟膠囊（浙江愛生藥業(yè)有限公司，批號20200303，規(guī)格：100 mg）；甲醇（北京迪馬科技有限公司，色譜純），水為純化水（自制）。

1.2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent 5 HC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相；甲醇-乙腈-水（25∶35∶40）；檢測波長：241 nm；柱溫：30℃；流速：1.00 ml/min；進(jìn)樣量：20 μl。

1.2.2 對照品溶液的制備 取黃體酮對照品約10 mg，精密稱定，置于50 ml量瓶中，加甲醇適量，振搖使黃體酮溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.2.3 供試品溶液的制備 取本品20粒，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于黃體酮50 mg），置于100 ml量瓶中，加甲醇適量，超聲使黃體酮溶解，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 ml，置于25 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.2.4 含量測定結(jié)果 根據(jù)試驗(yàn)過程，含量計(jì)算公式可表示為式中：Q:黃體酮軟膠囊標(biāo)示百分含量（%）；Ay:供試品溶液的峰面積；Ad：對照品溶液的峰面積；Wd:對照品稱樣量（mg）；Wy:供試品稱樣量（g）；P:對照品的純度；Vd：對照品的稀釋體積（ml）；Vy1：供試品的一次稀釋體積（ml）；Vy2：供試品二次稀釋時移液管取樣體積（ml）；Vy3：供試品的二次稀釋體積（ml）；W:供試品的平均片重（g）；100：供試品的規(guī)格（mg）。計(jì)算結(jié)果：黃體酮軟膠囊含量為標(biāo)示量的95.30%。

1.3 不確定度分量來源的分析 從公式中看出HPLC法測定黃體酮軟膠囊含量的測量不確定主要源于①對照品方面：對照品純度、對照品稱量、對照品稀釋和對照品溶液色譜峰面積；②樣品部分：樣品平均片重、樣品稱量、樣品稀釋以及樣品溶液色譜峰面積。天平的校準(zhǔn)和稱量的重復(fù)性是稱量不確定度的主要來源；稀釋的不確定度來源于玻璃儀器的校準(zhǔn)及使用溫度；峰面積的不確定度來源于高效液相色譜儀的重復(fù)性及儀器所處的環(huán)境和性能。

2 各分量的不確定度分析

2.1 對照品純度引起的相對不確定度urel（P） 黃體酮對照品購自中國食品藥品檢定研究院，105℃干燥3 h后使用，純度為99.6%，由于中檢院尚未給出不確定度，現(xiàn)假定其分散區(qū)間的半寬度為α=0.25%，按B類不確定度，矩形分布計(jì)算，取包含因子則對照品純度引入的不確定度為=1.45×10-3。

2.2 對照品稱量引起的相對不確定度urel（Wd） 來源主要有兩個：天平的示差和天平稱量的重復(fù)性。天平示差的不確定度：根據(jù)電子天平檢定證書：820022887-011，其示差誤差為±0.05 mg，按B類不確定度，矩形分布分析，取包含因子其不確定度為天平稱量重復(fù)性的不確定度：電子天平檢定證書：820022887-011，其給出天平示值重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1 mg，按B類不確定度，矩形分布分析，其不確定度為=5.77×10-2。則單次稱量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為本法采用減重法進(jìn)行稱量，并進(jìn)行2次稱量，所以不確定度為兩份對照品稱樣量分別為10.31 mg和10.44 mg，則對照品稱量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=1.24×10-2。

2.3 對照品稀釋引起的相對不確定度urel（Vd） 對照品溶液制備過程中有稀釋步驟，稀釋過程中包含玻璃儀器的不確定度。玻璃儀器的不確定度主要包含兩個方面；第一，量瓶體積校準(zhǔn)的不確定度。根據(jù)JJG196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》，A級50 ml量瓶的容量允差為±0.05 ml，按B類不確定度，矩形分布分析，取包含因子=5.77×10-4。第二，量瓶校準(zhǔn)時的溫度與試驗(yàn)時使用溫度差異。試驗(yàn)時環(huán)境溫度為18℃，按照J(rèn)JG196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》，水的體積膨脹系數(shù)為0.000 21 ml/℃，因此50 ml量瓶產(chǎn)生的體積變化為50×0.000 21×2=0.021 ml，按照矩形分布，屬于B類不確定度，取包含因子，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為綜上 對照品稀釋引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=2.42×10-4。

2.4 對照品溶液色譜峰面積的相對不確定度urel（Ad）色譜峰面積不確定度的主要影響因素為峰面積重復(fù)性、儀器、環(huán)境、進(jìn)樣體積等。由于對照品溶液與供試品溶液在基本相同的條件下進(jìn)樣，儀器環(huán)境、進(jìn)樣體積等因素造成的不確定度可互相抵消，所以忽略儀器環(huán)境和進(jìn)樣的影響。故峰面積重復(fù)性是影響對照品溶液峰面積不確定度的主要因素。本次試驗(yàn)中，對照品1重復(fù)進(jìn)樣3次，峰面積分別為9 950 591、9 974 909和9 978 032，平均值為9 967 844，對照品峰面積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為相對不確定度為對照品2進(jìn)行2次重復(fù)進(jìn)樣，峰面積各為9 895 362和9 926 831，平均值為9 911 097，對照品峰面積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為相對不確定度為對照品峰面積的相 對 不確定度為=2.70×10-3。

2.5 平均片重引起的相對不確定度urel（W） 精密稱定供試品20粒，求得總重為5.034 2 g，平均片重為W=0.251 7 g/片，不確定度分析同“2.2”項(xiàng)下。由天平校準(zhǔn)引起的不確定度為urel（W）1由天平稱量重復(fù)性引起的不確定度為=1.99×10-5。故由樣品平均片重引起的相對不確定度為。

2.6 供試品稱量引起的相對不確定度urel（Wy）本次試驗(yàn)供試品共取2份：Wy1=0.167 1 g；Wy2=0.170 8 g，不確定度分析同“2.2”項(xiàng)下。由天平校準(zhǔn)引起的不確定度為由天平稱量重復(fù)性引起的不確定度為故供試品稱量引起的相對不確定度為urel（Wy）

2.7 供試品稀釋引起的相對不確定度urel（Vy） 不確定度分析同“2.3”項(xiàng)下。根據(jù)國家計(jì)量檢定規(guī)程規(guī)定，A級100 ml量瓶的容量允差為±0.10 ml，A級25 ml量瓶的容量允差為±0.03 ml，A級10 ml移液管的容量允差為±0.020 ml，按B類不確定度，矩形分布分析，取包含因子，則100 ml量瓶引起的相對不確定度為=2.43×10-4；25 ml量瓶引起的相對不確定度為10 ml移液管引起的相對不確定度為urel（Vy）3由樣品稀釋引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度由以上3項(xiàng)合成得到

2.8 供試品溶液色譜峰面積的相對不確定度urel（Ay） 供試品溶液的色譜峰面積采用雙樣雙平行進(jìn)行測定，測定的結(jié)果用極差法計(jì)算，記錄雙樣測量峰面積分別為：10368772、10342117及11219389、11 214 004，因 此，=10 355 445，Ry1=10 368 772-10 342 117=26 655；=11219389-11 214 004=5 385。取n=2時的極差系數(shù)C=1.13，則供試品溶液色譜峰面積的相對不確定度為=2.32×10-3。

3 計(jì)算合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

4 給出擴(kuò)展不確定度

試驗(yàn)結(jié)果一般用擴(kuò)展不確定度來表示，取包含因子k=2（置信概率約為95%），則含量測定擴(kuò)展不確定度uc（Q）=2×uc（Q）=2×1.24%=2.48%。含量測定結(jié)果可表示為Q+U（Q）:95.3%±2.48%，k=2（95%的置信區(qū)間）。

5 討論

對HPLC法測定黃體酮軟膠囊的含量的不確定度分析，得到檢測結(jié)果的擴(kuò)展不確定度為2.48%（k=2）。由上述評估過程可知，在HPLC測量黃體酮軟膠囊的含量中，對照品的稱量是不確定度分析中對不確定度影響最大的一個分量，其次是色譜峰面積形成的影響。因此在日常試驗(yàn)中要做好質(zhì)量控制，嚴(yán)格規(guī)范稱量、稀釋、進(jìn)樣等關(guān)鍵步驟。對于稱量來說，試驗(yàn)中可采取增加稱樣量和選用更高精度的天平的方法來減少稱量對不確定的影響，嚴(yán)格按照《中國藥典》稱量要求進(jìn)行稱量，控制實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，保持適宜的溫度和濕度，以減少環(huán)境對稱量及其他試驗(yàn)步驟的影響；就色譜峰面積而言，可以考慮重復(fù)多次進(jìn)樣來減少其對不確定度的影響，定期做好儀器維護(hù)和期間核查保證儀器的正常性能。

試驗(yàn)中的人員、儀器、試劑、試驗(yàn)方法、環(huán)境等各個方面都會影響試驗(yàn)的準(zhǔn)確性［4］。要把好試驗(yàn)過程中的每一關(guān)。做好人員培訓(xùn)，盡量減少試驗(yàn)操作上的誤差；在日常中要做好儀器維護(hù)，確保儀器性能，定期做好玻璃器具的檢定，保證試驗(yàn)使用的各種儀器器具都是在正常的狀態(tài)；在采購驗(yàn)收時要注重產(chǎn)品質(zhì)量，為試驗(yàn)打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)；試驗(yàn)時確認(rèn)試驗(yàn)方法，保證按標(biāo)檢驗(yàn)；維護(hù)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境為試驗(yàn)提供一個適宜的溫濕度環(huán)境，并保持環(huán)境的穩(wěn)定減少環(huán)境改變帶來的影響。而且在試驗(yàn)過程中，盡量減少稀釋步驟，如必須稀釋可進(jìn)行更大體積的稀釋，以減少試驗(yàn)誤差。通過這些方法可降低合成相對不確定度，提高檢驗(yàn)質(zhì)量。

測量不確定度作為評定測量結(jié)果可信度的依據(jù)，在評價分析方法、實(shí)驗(yàn)室評定、確定測試人員的技術(shù)水平及判定藥品質(zhì)量是否準(zhǔn)確方面都具有重要意義［6-7］。評定不確定度時，應(yīng)盡量將產(chǎn)生不確定度的所有來源都考慮周全，因?yàn)橹匾牟淮_定度分量幾乎完全取決定合成不確定度的數(shù)值。由本文的研究也提示本文建立的測量不確定度評定方法，也可以為其他藥品應(yīng)用高效液相法進(jìn)行含量測定的測量不確定度的評定提供參考，為液相方法測定含量提供技術(shù)上的支持，關(guān)注誤差來源，減少誤差的產(chǎn)生，提高測量數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。