李瑞明，楊夢雅，3，孫彩虹，3，羅學軍*

（1.天士力控股集團有限公司研究院現(xiàn)代中藥開發(fā)中心，天津300410；2.天士力醫(yī)藥集團股份有限公司創(chuàng)新中藥關(guān)鍵技術(shù)國家重點實驗室，天津300410；3.中國藥科大學中藥學院，江蘇210009）

三七葉系五加科人參屬植物三七Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen的干燥莖葉，其性溫，味辛，主要用于止血、消腫、定痛，治吐血、衄血、便血、外傷出血、癰腫毒瘡、跌打腫痛、偏頭痛等癥，主要產(chǎn)區(qū)為云南、廣西［1-4］。近年研究表明三七的莖葉可供藥用，且毒副作用小。三七葉的活性成分三七葉皂苷屬達瑪烷型三萜皂苷，其對血液系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和代謝系統(tǒng)作用與三七根皂苷相似。由于人們的傳統(tǒng)習慣多以根入藥，對三七莖葉資源綜合利用研究很少［5］?，F(xiàn)已報道從三七莖葉中分離得到的皂苷成分有23種，三七莖葉含總皂苷約4%~6%，其中人參皂苷Rb3含量最高［6］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Waters Aquity Arc-Qda HPLC（Water公司）；梅特勒XS205DU分析天平（梅特勒托利多公司）；U-3900紫外分光光度計（日立公司）。

1.2 試藥18批三七葉，包括13批3年生（編號19-3-1~19-3-13，其中19代表2019年采收，3代表3年生，1~13為流水號）和5批2年生（19-2-1~19-2-5）于2019年11—12月采自云南和四川，另12批均為3年生（編號20-3-1~20-3-12）于2020年11—12月采自云南，均依據(jù)1990版廣西省中藥材標準三七葉項下性狀及鑒別要求進行鑒別，均符合標準要求。人參皂苷Rb3（批號111686-201504，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇、石油醚（30~60℃）、正丁醇、香草醛均為市售分析純；乙腈為色譜純（批號JA088630，Merck公司）。

2 人參皂苷Rb3含量測定的方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbox SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）流動相：乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0~19 min，30%→35%乙腈；19~21 min，35%→50%乙腈；21~26 min，50%乙腈；檢測波長：203 nm；流速：1 ml/min；柱溫：30℃；進樣量：10 μl。理論板數(shù)按人參皂苷Rb3峰計算應(yīng)不低于6 000。

2.2 三七葉樣品的前處理 將2019年采集的13批3年生樣品分別分解成葉部、莖部和基部（整株最下端2~3 cm），2019年5批2年生及2020年12批3年生樣品保持全株，分別粉粹，過2號篩。

圖1 3年生三七葉部位分解圖

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 取人參皂苷Rb3對照品適量，精密稱定，加乙醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備 取本品粗粉0.2 g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇40 ml，加熱回流3 h，提取液揮干，加水10 ml使溶解，加石油醚（30~60℃）萃取3次，每次10 ml，棄去醚液，水層加水飽和正丁醇萃取3次，每次10 ml，收集正丁醇層，水層棄去。正丁醇液水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解并定量轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考查 分別吸取上述對照品溶液2、4、6、8、10和12 μl，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以人參皂苷Rb3進樣量為橫坐標，以峰面積數(shù)值為縱坐標，繪制人參皂苷Rb3的標準曲線?；貧w方程Y＝274.82 X+2.173 3（r=0.999 9）。即人參皂苷Rb3進樣量范圍為0.98~5.92 μg時，線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗 取上述對照品溶液10 μl重復(fù)連續(xù)進樣6次，以峰面積計算，RSD為0.17%，表明儀器精密度良好。

2.6 重現(xiàn)性試驗 取三七葉6份，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，分別測定，RSD為0.93%，結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取方法重現(xiàn)性中第1份樣品，在室溫條件下分別于2、4、8、12和24 h時精密吸取10 μl注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，RSD為1.67%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率 精密稱取適量人參皂苷Rb3對照品，加甲醇制成每1 ml含0.551 mg的溶液，作為對照品儲備液。精密稱取三七葉樣品約0.1 g，置索氏提取器中，精密加入對照品儲備液5 ml和甲醇35 ml，依照供試品溶液制備方法制備，平行制備6份，測定，計算回收率。結(jié)果6份樣品平均回收率為98.59%，RSD為1.85%。見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.9樣品測定 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，測定，結(jié)果見表2。不同生長年限比較：3年生的整株樣品平均含量為1.89%（除19-3-13批外），2年生的整株樣品平均含量為1.38%。不同部位的比較：葉部、莖部和基部中人參皂苷Rb3平均含量分別為2.19%、0.07%和0.05%；把葉、莖和基部加和作為一個整體，并按照葉、莖和基部占整體的質(zhì)量占比，計算可得葉部中占98.20%，莖部中占1.58%，基部中只占0.23%。不同采收年份的比較：2019年采集的12批和2020年采集的12批3年生三七葉整株中人參皂苷Rb3平均含量為1.41%和2.41%。

表2 不同樣品中人參皂苷Rb3含量測定結(jié)果

3 總皂苷含量檢測方法與結(jié)果

3.1 方法 照紫外可見分光光度法測定（《中國藥典》2015版四部通則0401）。

3.2 供試品及對照品溶液的制備 取“2.3.1”項下對照品溶液，用甲醇稀釋成0.05、0.1、0.15、0.2和0.25 mg/ml，作為對照品溶液。取“2.3.2”項下各供試品溶液1 ml，加甲醇稀釋至10 ml，作為供試品溶液。

3.3 測定法 精密量取對照品溶液及供試品溶液各1 ml，置10 ml具塞試管中，水浴蒸干，精密加入新配制的5%的香草醛冰醋酸-高氯酸（1∶4）的混合溶液1 ml，搖勻，密塞，置60℃水浴中加熱10 min，取出，流水冷卻，精密加入冰醋酸5 ml，搖勻，以試劑作空白。照紫外可見分光光度法，在550 nm的波長處測定吸收度，即得。

3.4 線性關(guān)系考查 分別檢測濃度為0.05、0.1、0.15、0.2和0.25 mg/ml的對照品溶液并繪制標準曲線，得標準曲線為Y=2.307 X+0.215 3（r=0.995 3），線性關(guān)系良好，其濃度范圍為0.05~0.25 mg/ml。

3.5 總皂苷含量測定 對19-3-4、19-3-6、19-3-8 3批3年生，19-2-1、19-2-4、19-2-5 3批2年生，及19-3-13（霜凍3年生三七葉）進行了總皂苷檢測。結(jié)果顯示：3年生的整株總皂苷含量平均值為5.70%，葉、莖和基部分別為10.61%、1.06%和0.70%，2年生整株的平均含量為5.30%。經(jīng)過霜凍過后的三七葉葉部的總皂苷含量低于正常水平。按照葉、莖和基部占整體的質(zhì)量占比，計算得到總皂苷在葉部占94.96%，莖部占3.20%，基部只占0.65%，分布與人參皂苷Rb3類似。見表3。

表3 不同樣品中總皂苷含量測定結(jié)果

4 討論

4.1 由以上結(jié)果可知，人參皂苷Rb3及總皂苷均主要分布在葉部，占比95%~99%，莖和基部中僅占1%~5%，因此在生產(chǎn)中可以通過控制莖葉比例來控制三七葉的質(zhì)量。

4.2 人參皂苷Rb3含量測定方法是針對三七葉整株開發(fā)的方法，由于莖部和基部中人參皂苷Rb3含量極低，已超出線性范圍，雖然其含量存在一定偏差，但是不影響本文的研究結(jié)論。

4.3 本研究表明霜凍天氣對三七葉人參皂苷Rb3和皂苷含量有重大影響，如19-3-1批中人參皂苷Rb3含量為2.42%，霜凍后采樣中僅為0.66%，因此遭受霜凍后的三七葉不建議采收。據(jù)文獻［7］報道：人參莖葉因霜凍導(dǎo)致細胞壁破裂，細胞內(nèi)的糖苷酶得以釋放，將人參皂苷分解。三七葉的人參皂苷Rb3含量在霜凍后減少的機制可能與人參莖葉一致。

4.4 2019 年和2020年采收的樣品中人參皂苷Rb3含量相差1%，目前尚沒有合理的解釋，依據(jù)“4.3”項下結(jié)論推斷可能與生長及采收期間氣候變化有關(guān)，建議繼續(xù)采集1~2年的樣品進行跟進研究。