紀(jì)東漢， 王甫成*， 朱曉妮， 李培培， 龔道鋒

(1.亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 亳州 236800;2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院 亳州中醫(yī)藥研究所，安徽 亳州 236800)

女貞子為木犀科植物女貞(

Ligustrum

lucidum

Ait.)的干燥成熟果實(shí),是中醫(yī)臨床上扶正固本的常用中藥。其性味甘、苦、涼,具有滋補(bǔ)肝腎、明目烏發(fā)之效,用于肝腎陰虛,骨蒸潮熱等癥。其化學(xué)成份主要有三萜類、黃酮類、苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜類、多糖類等,其成分變化與采收時(shí)間存在有一定的關(guān)系。

女貞子臨床多以炮制品入藥,常見炮制方法有凈制、蒸制、酒制、鹽制、醋制等。關(guān)于女貞子炮制前后化學(xué)成分含量變化已有諸多報(bào)道,概括為女貞子經(jīng)炮制后其中所含環(huán)烯醚萜類成分(特女貞苷、女貞苷G13、女貞苷等)含量下降,苯乙醇苷類成分(紅景天苷、酪醇,羥基酪醇等)升高,但相關(guān)研究以酒制(黃酒)為主。女貞子炮制除酒制(黃酒)外,各地方炮制規(guī)范中仍有醋制、鹽制、單蒸等其他制法,雖有部分文獻(xiàn)就醋制、鹽制等方面進(jìn)行研究,但多為實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì),炮制方法與地方炮制規(guī)范有差異,針對(duì)女貞子不同地方炮制規(guī)范所制炮制品的成分變化研究較少。

目前,全國各地方中藥炮制規(guī)范中關(guān)于女貞子的炮制方法有20余種,不同省市間炮制規(guī)范所制得女貞子炮制品成分含量有無較大差異,現(xiàn)尚不明確。為此本實(shí)驗(yàn)通過查閱不同省市中藥炮制規(guī)范,按輔料類型和炮制工藝選取了8種代表性方法(黃酒蒸、黃酒燉、單蒸、米酒蒸、鹽蒸、醋蒸、白酒燉、鹽炒),采取高效液相色譜法對(duì)8種地方炮制規(guī)范炮制前后女貞子中4種成分含量進(jìn)行測定,總結(jié)4種成分在炮制前后含量變化情況,為女貞子的地方炮制規(guī)范修定提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 儀器 安捷倫(Agilent)1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫);AUW220D型電子分析天平(日本島津);KQ-400E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);HH-S2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州普天儀器制造有限公司);JC101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海成順儀器儀表有限公司)。

1.1.2 試劑 乙腈(默克股份有限公司,色譜純);磷酸(天津市科密歐化學(xué)試劑公司,分析純);95%乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司,分析純);純凈水(娃哈哈集團(tuán));女貞苷G13對(duì)照品(北京普天同創(chuàng)生物科技公司,批號(hào)MuST-17022211,純度≥98.0%);紅景天苷對(duì)照品(成都普菲德生物公司,批號(hào)60315,純度≥98.0%);特女貞苷對(duì)照品(北京普天同創(chuàng)生物科技公司,批號(hào)MuST-16021904,純度≥98.0%);酪醇對(duì)照品(成都普菲德生物技術(shù)有限公司,批號(hào)151028,純度≥98.0%);黃酒(酒精度:12%,紹興女兒紅釀酒有限公司);小米香醋(紹興市釀造有限公司);米酒(湖北爽露食品有限公司);食鹽(安徽省鹽業(yè)總公司);白酒(酒精度:45%,安徽古井貢酒股份有限公司),女貞子(采購于安徽省亳州市康美中藥材市場,由亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院王甫成教授鑒定其為木犀科植物女貞

Ligustrum

lucidum

Ait.的干燥成熟果實(shí))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱:(Aglient Zorbax SB-C18,4.60×250 mm,5 μm),流動(dòng)相:乙腈(A),0.1%磷酸水(B),梯度洗脫:0～15 min,A:5%～12%;15～60 min,A:10%～33%;60～70 min,A:35%～82%;70～85 min,A:85%～95%,流速:1.0 mL/min,檢測波長:224 nm,柱溫:25 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。

1.2.2 女貞子炮制樣品制備 通過對(duì)不同省市女貞子的炮制規(guī)范的查閱發(fā)現(xiàn),除河南、河北等地生品可以直接入藥外,其余省份都需要炮制后才入藥。其中以黃酒制(酒蒸、酒燉)最為常見,除此之外還有醋制、鹽制、單蒸等方法。由于很多省市炮制規(guī)范中沒有明確規(guī)定炮制時(shí)間,為保障實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行,最終由各省市炮制規(guī)范中按不同輔料及炮制工藝選取了8種炮制方法為代表進(jìn)行試驗(yàn)。選用的8種炮制方法具體見表1。

表1 8種女貞子炮制方法Table 1 8 kinds of processing methods of Ligustrum lucidum

1.2.3 供試品溶液制備 取女貞子生品及不同炮制樣品(黃酒蒸、黃酒燉、鹽蒸、醋制、白酒燉、米酒蒸、鹽炒、單蒸)粉碎后過三號(hào)篩,取粉末約0.5 g,精密稱定。加入稀乙醇50 mL,回流提取1 h,放冷后補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液即得。

1.2.4 對(duì)照品溶液制備 分別取紅景天苷、酪醇、特女貞苷、女貞苷G13對(duì)照品適量置于容量瓶中,加甲醇溶解,配成0.404 mg/mL、0.214 mg/mL、1.060 mg/mL、1.050 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取一定量已配好的對(duì)照品儲(chǔ)備液置于容量瓶中用甲醇稀釋定容,分別配制6個(gè)濃度梯度的混合對(duì)照品溶液,紅景天苷濃度范圍2.02～60.60 μg/mL;酪醇濃度范圍1.07～32.10 μg/mL;特女貞苷濃度范圍42.40～318.00 μg/mL;女貞苷G13濃度范圍42.00～315.00 μg/mL。

1.2.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取1.2.4節(jié)混合對(duì)照品溶液各10 μL,注入液相色譜儀,記錄峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)X,峰面積為縱坐標(biāo)Y,計(jì)算回歸方程。

1.2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 分別取低、中高3個(gè)質(zhì)量濃度梯度的紅景天苷(5.05、25.25、50.50 μg/mL),酪醇(2.14、10.07、25.68 μg/mL),特女貞苷(84.80、169.60、254.40 μg/mL),女貞苷G13(84.00、168.00、252.00 μg/mL)混合對(duì)照品溶液作為質(zhì)控(QC)樣品,每一質(zhì)量濃度平行3份,分別重復(fù)進(jìn)樣6次,每次10 μL,根據(jù)4種成分的峰面積計(jì)算精密度。

1.2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取女貞子生品,精密稱定,按1.2.3節(jié)制備樣品溶液,分別于0、2、4、8、12 h進(jìn)樣,每次10 μL,根據(jù)4種成分的峰面積計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取女貞子生品,精密稱定,按1.2.3節(jié)制備樣品溶液6份,每份樣品進(jìn)樣10 μL,根據(jù)4種成分的峰面積計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.9 加樣回收實(shí)驗(yàn) 取女貞子生品6份,精密稱定,精密加入對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,按1.2.3節(jié)制備樣品,每份樣品進(jìn)樣10 μL,根據(jù)4種成分的峰面積計(jì)算加樣回收率。

1.2.10 含量測定 將女貞子生品及8種不同炮制品按1.2.3節(jié)制備成供試品溶液,進(jìn)樣10 μL,根據(jù)紅景天苷等4種成分的峰面積計(jì)算含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考查

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液各10 μL,注入液相色譜儀,記錄峰面積。以對(duì)照品濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)X,峰面積為縱坐標(biāo)Y,計(jì)算回歸方程,由表2可得4種成分的回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)。

表2 4種成分回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)Table 2 4 component regression equations, linear range and correlation coefficient

2.2 精密度和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

根據(jù)上述色譜條件,分別取低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度梯度的紅景天苷(5.05、25.25、50.50 μg/mL),酪醇(2.14、10.07、25.68 μg/mL),特女貞苷(84.80、169.60、254.40 μg/mL),女貞苷G13(80.00、168.00、252.00 μg/mL)混合對(duì)照品溶液(QC樣品),每次進(jìn)樣10 μL,重復(fù)進(jìn)樣6次,計(jì)算精密度和準(zhǔn)確度,準(zhǔn)確度計(jì)算=(實(shí)測質(zhì)量濃度-質(zhì)控樣品濃度)/質(zhì)控樣品濃度。由表3可得,4種成分的精密度和準(zhǔn)確度均較好，符合要求。

表3 4種成分的精密度和準(zhǔn)確度(n=6)Table 3 Precision and accμracy of 4 components (n=6)

2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取女貞子生品粉末適量,按照上述供試品溶液制備方法1.2.3節(jié)平行制備成6份供試品溶液,分別進(jìn)樣測定,測得紅景天苷、酪醇、特女貞苷、女貞苷G13平均含量分別為0.031 6%、0.014 3%、1.175 7%、1.141 4%,RSD分別為1.40%(

n

=6)、1.82%(

n

=6)、2.04%(

n

=6)、1.91%(

n

=6)結(jié)果表明其重復(fù)性良好

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取女貞子生品,按制備方法1.2.3節(jié)操作,制備成供試品溶液,分別于0、2、4、8、12 h時(shí)精密吸取10 μL進(jìn)樣,測得酪醇、紅景天苷、女貞苷G13、特女貞苷峰面積RSD值,結(jié)果分別為1.28%(

n

=5)、1.83%(

n

=5)、2.08%(

n

=5)、1.92%(

n

=5)從所得數(shù)據(jù)看出,供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 加樣回收率

由表4可得4種成分的加樣回收率,紅景天苷、酪醇、特女貞苷、女貞苷G13的加樣回收率分別為100.71%、101.36%、102.58%、101.26%,RSD分別為1.92%、2.47%、2.50%、2.41%。表明該方法符合女貞子的含量測定要求。

表4 女貞子中4種成分加樣回收結(jié)果(n=6)Table 4 Recovery results of four components in Fructus Ligustri (n=6)

2.6 樣品含量測定

由表5可得,女貞子炮制前后4種成分的含量有著一定的變化,總體為特女貞苷,女貞苷G13含量下降,紅景天苷,酪醇含量上升;由圖1可得,不同炮制方法間存在有一定的差異。相關(guān)色譜圖見圖2～3。

表5 女貞子樣品含量測定結(jié)果(n=3)Table 5 Determination results of ligustrum ligμstri fruit samples (n=3)

圖1 女貞子生品與不同炮制品4種成分變化柱狀圖Fig.1 Histogram of changes of four components of fructus Ligustri ligustri raw products and different processed products

圖2 混合對(duì)照品色譜圖Fig.2 Chromatogram of mixed reference substance

1.紅景天苷 2.酪醇 3.特女貞苷4.女貞苷G-13

3 結(jié)論與討論

通過對(duì)混合對(duì)照品溶液波長掃描,發(fā)現(xiàn)4種成分最大吸收波長各有不同,通過不同吸收波長圖譜對(duì)比,選擇檢測波長為224 nm,試驗(yàn)同時(shí)考察了不同流動(dòng)相(乙腈-水,乙腈-磷酸溶液,乙腈-乙酸溶液),最終確定,乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫效果較好,最終確認(rèn)該條件為本研究色譜條件。

研究結(jié)果顯示,不同的炮制方法對(duì)女貞子中4種成分的含量變化有著明顯的影響,總體趨勢(shì)為特女貞苷,女貞苷G13含量下降,紅景天苷,酪醇含量上升,8種不同炮制方法中,加熱時(shí)間較長的炮制方法(黃酒燉、黃酒蒸等)4種成分變化較加熱時(shí)間短的的炮制方法(醋蒸、白酒燉等)變化更為明顯。炮制過程中紅景天苷、酪醇含量上升,特女貞苷、女貞苷G13含量下降原因可能為在水分與加熱的條件下,特女貞苷、女貞苷G13發(fā)生水解反應(yīng),產(chǎn)生了紅景天苷、酪醇單元。張學(xué)蘭等、宋夢(mèng)涵等的研究也已證實(shí),女貞子中的環(huán)烯醚萜苷類如特女貞苷等,其分子上環(huán)烯醚萜部分以酯鍵與紅景天苷或酪醇等苯乙醇苷類化合物相連,其性質(zhì)不穩(wěn)定,加熱和水所產(chǎn)生的高溫悶熱導(dǎo)致酯鍵水解,生成紅景天苷及酪醇等苯乙醇苷類物質(zhì)。所以炮制后環(huán)烯醚萜苷類成分含量下降,苯乙醇苷類成分含量上升。這種變化會(huì)隨加熱時(shí)間的延長持續(xù)進(jìn)行。鑒于2020版《中國藥典》已將紅景天苷作為酒女貞子質(zhì)量控制成分,所以在女貞子的炮制工藝優(yōu)化時(shí),適當(dāng)延長炮制時(shí)間可能會(huì)有更好的效果。鹽炒女貞子酪醇含量下降,可能因?yàn)槌粗茣r(shí)溫度較高導(dǎo)致酪醇分解所致。

有關(guān)女貞子炮制前后成分變化的研究已有較多文獻(xiàn)報(bào)道,但相關(guān)研究較為零散,多數(shù)為女貞子酒制(黃酒)前后成分含量變化,有些選用不同炮制方法研究炮制前后女貞子化學(xué)成分含量變化,也多為酒制(黃酒)、醋制、鹽制且炮制方法多為實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì),與地方炮制規(guī)范存在差異。本實(shí)驗(yàn)選取了各省市地方炮制規(guī)范中的8種代表性方法(黃酒蒸、黃酒燉、單蒸、米酒蒸、鹽蒸、醋蒸、白酒燉、鹽炒),比較了8種地方炮制規(guī)范炮制后女貞子4種成分變化,為女貞子地方炮制規(guī)范研究以及科學(xué)評(píng)價(jià)女貞子飲片質(zhì)量提供一定的依據(jù),也為女貞子不同炮制品的臨床應(yīng)用提供參考。