張勁宜 方善鈺 周婧君

（1.萍鄉(xiāng)市婦幼保健院婦產(chǎn)科，江西 萍鄉(xiāng) 337300；2.重慶醫(yī)科大學(xué)重慶 400010）

卵巢癌其發(fā)病率為婦科惡性腫瘤第三，死亡率卻第一位[1]。但是本病I 期患者5 年生存率大于90%，而晚期僅為29%[2-3]。近年來，超聲分子影像學(xué)已成為國(guó)際研究焦點(diǎn)。目前的超聲納米分子造影劑可通過單乳法和碳二亞胺法制備，再通過冷凍干燥法使粒徑最小，而包裹全氟已烷（Perfluorohexan，PFH）的是聚乳酸-羥基乙酸共聚物(Poly-lactic-co-glycolic acid-cooh，PLGACOOH)高分子材料，穩(wěn)定性較高，在高強(qiáng)度聚焦超聲(High intensity focused ultraso-und，HIFU)的輻照下，能使液相的PFH 造影劑轉(zhuǎn)變成氣相的超聲納米微泡分子造影劑，從而使超聲增強(qiáng)顯像[4]。聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA-COOH）通過化學(xué)作用連接特異性配體，形成穩(wěn)定的化學(xué)鍵[5-6]。

HE4（Human epididymis protein4,HE4）又被稱作人附睪蛋白4[7]。有研究顯示，HE4 在婦女的卵巢癌組織中表達(dá)較高，在其他正常與不正常組織、系統(tǒng)中找不到[8-10]。將HE4 偶聯(lián)在納米造影劑表面，通過靶向能夠牢固地聚集在腫瘤細(xì)胞上并能從分子水平識(shí)別，從而液相變產(chǎn)生特異性增強(qiáng)顯像。此外，通過一定功率的HIFU 輻照和超聲波聲壓效應(yīng)的作用，理論上能夠使液體的全氟已烷（Perfluorohexan，PFH）變?yōu)闅怏w，進(jìn)而達(dá)到在超聲上能增強(qiáng)顯影效果。

基于以上認(rèn)識(shí)，本研究先用聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA-COOH)、PFH、人附睪蛋白4-聚乙二醇-氨基（HE4-poly(Ethylene glycol)PEG-NH2）等通過單乳化法及碳二亞胺法，分散、溶解、離心制備得到人附睪蛋白4-全氟已烷-聚乳酸（HE4-PFHPLGA）納米高分子造影劑，確定HE4 與普通全氟已烷-聚乳酸（PFH-PLGA）造影劑同樣具有良好的鏈接性和穩(wěn)定性后，在裸鼠體內(nèi)驗(yàn)證了HE4-PFHPLGA 用作卵巢癌靶向超聲造影劑的效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料

PLGA-COOH（深圳市魅羅科技有限公司）、PFH（美國(guó)Sigma 公司）、HE4-PEG-NH2（重慶川東化工有限公司化學(xué)試劑廠）、德國(guó) Ependorf公司旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、DFY 型超聲圖像定量分析診斷儀（重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像實(shí)驗(yàn)室）

1.2 HE4-PFH-PLGA 冷凍納米高分子造影劑的制備

用電子秤稱取 100 mg PLGA 加入5 mL CH2CL2溶液中，用塑料薄膜封口，攪拌直至完全溶解；加入60 μL PFH，輕輕振蕩10 s；將 20 mL 1.5% SC 溶液加入上述混合液中，高速分散均質(zhì)機(jī)乳化5 min 后，置于冰箱中2 min；將燒杯放于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上用磁力攪拌器攪拌3 h，最大量使CH2CL2揮發(fā)；雙蒸水洗滌3 次，離心收集微球；取5 mL 微球溶解在MES 緩沖液中；以EDC 與NHS 比為1:3，PLGA 與EDC 比為1:10 的比例先后加入微球溶液中，4 ℃振蕩孵育30 min；用MES 洗滌混合液去除未反應(yīng)的EDC 與NHS；稱取10 mg HE4-PEG-NH2溶解在MES 緩沖液中并與上述所得PFH-PLGA 造影劑混勻，室溫振蕩孵化2 h，經(jīng)雙蒸水洗滌、離心，得到HE4-PFH-PLGA納米高分子造影劑。選取制備好的HE4-PFHPLGA 納米高分子造影劑，置于冷凍干燥機(jī)中 3天，蒸發(fā)多余的水分，減少粒徑長(zhǎng)度，再凍存于冰箱中。稱取5 mg 干燥之后的HE4-PFH-PLGA納米高分子造影劑，充分溶解在MES 緩沖液，沖洗離心直到濃度均為5 mg · mL-1HE4-PFH-PLGA納米高分子造影劑。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及裸鼠接種分組

用含10%滅活小牛血清的McCoys5A 培養(yǎng)基培養(yǎng)OVCAR-3 細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)；每4 天傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞種植在18 只雌性裸鼠身上，直到長(zhǎng)出15 mm 的移植瘤。將所有移植瘤裸鼠隨機(jī)分為3 組，每組6只，第1 組作為實(shí)驗(yàn)組，第2 組和第3 組作為對(duì)照組。

1.4 HE4-PFH-PLGA 體內(nèi)靶向性增強(qiáng)成像

第1 組移植瘤裸鼠通過尾靜脈注射200 μL HE4-PFH-PLGA 造影劑 (濃度為5 mg · mL-1)，6h后用HIFU 輻照 (10 W 6 min) 卵巢癌移植瘤部位觀察造影劑顯像；第2 組移植瘤裸鼠通過尾靜脈注射200 μL 非靶向PFH-PLGA 造影劑(濃度為5 mg · mL-1)，6 h 后用HIFU 輻照 (10 W 6 min) 卵巢癌移植瘤部位觀察造影劑顯像；第3 組移植瘤裸鼠通過尾靜脈注射200 μL HE4-PFH-PLGA 造影劑 (濃度均為5 mg · mL-1)，6 h 后在卵巢癌移植瘤部位直接觀察造影劑顯影。觀察HIFU 輻照前后卵巢癌移植瘤部位的造影顯影以及HE4-PFH-PLGA 聯(lián)合HIFU 成像對(duì)比。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SAS10.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE4-PFH-PLGA 納米高分子造影劑的穩(wěn)定性

完成HE4-PFH-PLGA 納米高分子造影劑的制備后冷凍干燥保存。普通光學(xué)顯微鏡下，HE4-PFHPLGA 納米高分子造影劑微球分布均勻，無團(tuán)聚，單個(gè)微球的外觀圓形；室溫保存7 d 后，其外觀仍完整，分布均勻，無團(tuán)聚，見圖1。

圖1 HE4-PFH-PLGA 納米高分子造影劑（×200 倍）

2.2 HE4-PFH-PLGA 體內(nèi)靶向超聲成像

把靶向造影劑和非靶向造影劑分3 組注入卵巢癌移植瘤部位6 h 后，觀察到實(shí)驗(yàn)組HE4-PFHPLGA 靶向高分子造影劑在HIFU 輻照下使微球轉(zhuǎn)變?yōu)槲⑴菰诔曄禄芈暶黠@增強(qiáng)（P ＜0.05），見圖2A、圖2B；其余的兩組對(duì)照組無明顯變化，見圖2C、圖2D、圖2E、圖2F。

圖2 HE4-PFH-PLGA 和PFH-PLGA 注入裸鼠在HFIU輻照前后圖片

3 討論

近年，超聲造影劑分子成像技術(shù)迅猛發(fā)展[11]。包裹PFH 的是PLGA-COOH 高分子材料，穩(wěn)定性較高，所以在本實(shí)驗(yàn)中HE4-PFH-PLGA，經(jīng)過震蕩，孵化都能保持一周以內(nèi)的微球狀態(tài)。且在HIFU 的輻照下，能使液相的PFH 造影劑轉(zhuǎn)變成氣相的超聲納米微泡分子造影劑[12-14]。氟碳液體的特性是可隨著溫度變化而變化，當(dāng)外界溫度到達(dá)58℃時(shí)氟碳液體可以轉(zhuǎn)變?yōu)闅怏w[15-16]。當(dāng)造影劑進(jìn)入裸鼠體內(nèi)可以避免體溫的影響從而達(dá)到造影效果。

本研究在卵巢癌移植瘤體內(nèi)超聲影像實(shí)驗(yàn)中,只有實(shí)驗(yàn)組HE4-PFH-PLGA 高分子造影劑通過HIFU 一定功率輻照后才能使超聲顯像造影回聲增強(qiáng)，說明HE4-PFH-PLGA 在體內(nèi)能有效靶向卵巢癌組織。這可能是因?yàn)榕悸?lián)HE4 的HE4-PFHPLGA 高分子造影劑納米微球能靶向卵巢癌移植瘤部位，并能有效聚集在腫瘤細(xì)胞表面。本研究中在卵巢癌移植瘤部位經(jīng)過HIFU 輻照達(dá)到一定溫度后納米微球中的PFH發(fā)生液相變使超聲造影成像。而PFH-PLGA 高分子造影劑雖經(jīng)過HIFU輻照，但其未攜帶靶向標(biāo)記物，不能到達(dá)腫瘤細(xì)胞表面聚集，不能有HIFU 滯留熱效應(yīng)而沒有超聲增強(qiáng)顯像。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功制備卵巢癌靶向HE4-PFH-PLGA 高分子造影劑，基本性質(zhì)穩(wěn)定，對(duì)卵巢癌移植瘤組織細(xì)胞具有明顯靶向性，在體內(nèi)經(jīng)過HIFU 一定功率的輻照有良好的超聲造影增強(qiáng)效果。為人們尋找更高效的靶向聲學(xué)顯像卵巢癌提供新方法。