蘇琴 崔麗賢 陳起民 謝慧婷 陳錦清 秦碧霞 朱英芝 李戰(zhàn)彪 蔡健和

摘要 番茄黃化曲葉病毒病是番茄生產(chǎn)上的毀滅性病害，嚴重影響番茄產(chǎn)量及品質(zhì)。2019年從廣西百色市采集疑似番茄黃化曲葉病葉片樣品，采用滾環(huán)擴增（RCA）及基因克隆等方法，獲得了4個煙粉虱傳雙生病毒的全基因序列，4個分離物的全長序列分別為2 776、2 781、2 752、2 781 bp，均編碼6個開放閱讀框;核苷酸相似性比較發(fā)現(xiàn)，4個分離物彼此間的相似性均在90%以上，與已報道的番茄黃化曲葉病毒Tomato yellow leaf curl virus （TYLCV）各分離物間的相似性也在91%以上;系統(tǒng)進化分析表明，TYLCV廣西分離物BS-2和BS-4與TYLCV-Hunan，BS-1和BS-3與TYLCV-YN6553等分離物處于獨立的小分支，說明TYLCV廣西分離物與TYLCV-Hunan、TYLCV-YN6553具有較近的親緣關(guān)系。本研究首次報道TYLCV在廣西發(fā)生。

關(guān)鍵詞 番茄; 番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）; 分子鑒定; 序列分析

中圖分類號： S 436.412.11

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020278

Molecular identification of Tomato yellow leaf curl virus in Guangxi province

SU Qin1#， CUI Lixian1#， CHEN Qimin2， XIE Huiting1， CHEN jinqing1，

QIN Bixia1， ZHU Yingzhi2， LI Zhanbiao1， CAI Jianhe1*

（1. Guangxi Key Laboratory of Biology for Crop Diseases and Insect Pests， Research Institute of Plant

Protection， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530007， China; 2. College of Marine

and Biotechnology， Guangxi University of Nationalities， Nanning 530006， China）

Abstract

Tomato yellow leaf curl disease （TYLCD） is one of the devastating diseases in tomato production， seriously reducing the yield and quality of tomato. In 2019， suspected TYLCD leaf samples were collected from Baise city， Guangxi Zhuang autonomous region. Four complete gene sequences of begomovirues transmitted by Bemisia tabaci were obtained by using rolling circle amplification （RCA） and gene cloning. The full-length sequences of the four isolates were 2 776， 2 781， 2 752 bp， and 2 781 bp， respectively， encoding six open reading frames. The nucleotide sequence identities between the four isolates were over 90%， and their identities against other Tomato yellow leaf curl virus （TYLCV） isolates were over 91%. Phylogenetic analysis showed that TYLCV Guangxi isolates BS-2 and BS-4 clustered with TYLCV-Hunan， and BS-1 and BS-3 clustered with TYLCV-YN6553 in a sub-clade， indicating their close relation. This is the first report of TYLCV infecting tomato in Guangxi.

Key words

tomato; Tomato yellow leaf curl virus （TYLCV）; molecular identification; sequence analysis

番茄黃化曲葉病毒Tomato yellow leaf curl virus （TYLCV）是一種嚴重危害番茄健康生產(chǎn)的毀滅性病毒，屬雙生病毒科Geminiviridae菜豆金色花葉病毒屬Begomovirus，基因組為單鏈環(huán)狀DNA，由煙粉虱Bemisia tabaci以持久循環(huán)方式傳播[1]。1964年，TYLCV首次在以色列被發(fā)現(xiàn)并正式命名，隨后迅速向世界各地蔓延，給番茄等農(nóng)作物生產(chǎn)造成了巨大的損失[1-3]。在我國，TYLCV于2006年首次在上海報道[4];隨后在江蘇、山東等20多個省市的番茄上被檢測到，且造成嚴重的危害[5-23]。

廣西是我國“南菜北運”的重要基地，番茄是其中重要的蔬菜品種，全區(qū)年種植面積約5.07萬hm2，主要分布在百色、南寧和桂林等地。自2000年以來，隨著傳播媒介昆蟲煙粉虱的暴發(fā)和擴散，番茄黃化曲葉病毒病連年猖獗，部分田塊甚至絕收，給番茄生產(chǎn)造成了極大損失。前期研究發(fā)現(xiàn)，引起廣西番茄黃化曲葉病毒病的病原主要包括：中國番茄黃化曲葉病毒Tomato yellow leaf curl China virus （TYLCCNV）、中國番木瓜曲葉病毒Papaya leaf curl China virus （PaLCuCNV）、中國勝紅薊黃脈病毒Ageratum yellow vein China virus （AYVCNV）、中國番茄曲葉病毒Tomato leaf curl China virus （ToLCCV）以及廣西番茄曲葉病毒Tomato leaf curl Guangxi virus（ToLCGxV）等5種[24-25]，尚未有TYLCV的報道。2019年，本團隊對廣西番茄病毒病的病原進行監(jiān)測，從采自百色市的番茄上檢測到TYLCV，并對其基因序列進行了分析，明確該分離物的進化來源，為進一步指導番茄黃化曲葉病毒病防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

從廣西壯族自治區(qū)百色市田陽縣（106.88°E，23.72°N）采集表現(xiàn)葉片黃化、卷曲、畸形、植株矮化等癥狀的番茄病葉12份，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總DNA提取

取番茄葉片樣品100 mg，用植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）抽提葉片總DNA。具體操作按照試劑盒說明書進行。最后將DNA沉淀溶解于50 μL ddH2O中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR檢測

利用菜豆金色花葉病毒屬病毒通用簡并引物AV494/CoPR[26-27]對番茄葉片總DNA進行PCR檢測，以本實驗室前期檢測為陽性的番茄總DNA作為陽性對照，健康番茄葉片總DNA作為陰性對照。反應(yīng)體系（20 μL）：總DNA 1 μL，10 μmol/L上、下游引物 AV494/CoPR 各0.5 μL，2×Taq MasterMix（Dye）（康為世紀生物科技有限公司） 10 μL， ddH2O 8 μL。

菌落PCR反應(yīng)體系（10 μL）：10 μmol/L上下游引物 AV494/CoPR 各0.5 μL，2×Taq MasterMix（Dye）5 μL，ddH2O 4 μL，滅菌牙簽挑取菌落作為模板溶解于PCR反應(yīng)體系中。

PCR反應(yīng)程序：95℃ 5 min;95℃ 30 s，54℃ 45 s，72℃ 30 s，35個循環(huán);72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 全基因序列擴增

以PCR檢測為陽性的番茄葉片總DNA為模板，利用TempliphiTM 100 Amplification Kit（GE Healthcare）進行滾環(huán)擴增（rolling circle amplification，RCA）。具體方法參考試劑盒說明書進行，簡述如下：滅菌PCR管中依次加入1 μL DNA和5 μL RCA溶液A，ddH2O補足至10 μL，95℃溫育3 min;取出后冰浴5 min;隨后加入5 μL RCA溶液 B和0.2 μL phi29 DNA聚合酶，ddH2O補足至20 μL，30℃溫育4～16 h，反應(yīng)結(jié)束后，擴增產(chǎn)物分別用BamH Ⅰ進行酶切。酶切反應(yīng)體系（總體積10 μL）：RCA產(chǎn)物2 μL、內(nèi)切酶1 μL、CutSmart 緩沖液1 μL、ddH2O 6 μL;37℃條件下酶切3 h，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果，并回收酶切產(chǎn)物。

1.5 基因克隆及序列分析

利用SanPrep 柱式 DNA 膠回收試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）回收RCA酶切產(chǎn)物，將經(jīng)回收純化的RCA產(chǎn)物克隆至經(jīng)同樣酶切且純化的pGEM-3Z載體（廣東農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所湯亞飛博士惠贈）;轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α，采用菌落PCR的方法篩選3個陽性克隆委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定。所得序列經(jīng)Vector NTI 11.0進行拼接后，使用NCBI的ORF Finder程序進行ORF 預(yù)測;利用MEGA 7.0的鄰接法（neighbor joining， NJ）構(gòu)建進化樹，bootstrap設(shè)置為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄樣品的PCR檢測

利用菜豆金色花葉病毒屬病毒簡并引物AV494/CoPR對番茄葉片總DNA進行PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采集的12份疑似番茄黃化曲葉病毒病的番茄樣品中有8份擴增出與陽性對照大小一致的特異條帶（570 bp），而健康番茄樣品中未擴增出任何條帶（圖1）。結(jié)果表明，采集的番茄樣品（8/12）受到菜豆金色花葉病毒屬病毒的侵染。

2.2 病毒分離物基因組全序列克隆及分析

挑選部分PCR檢測陽性的番茄總DNA（重新編號為：BS-1， BS-2，BS-3和BS-4），利用RCA試劑盒擴增病毒的全序列，將RCA產(chǎn)物進行酶切并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結(jié)果顯示RCA產(chǎn)物均可以被BamH Ⅰ切出一條約2.7 kb大小的條帶;將此條帶回收純化后克隆至同樣經(jīng)BamH Ⅰ 酶切的pGEM-3Z載體上并進行序列測定。所得序列經(jīng)拼接比對后發(fā)現(xiàn)，采集自百色市田陽縣的番茄樣品BS-1， BS-2，BS-3和BS-4等4個分離物的全長序列分別為2 776、2 781、2 752、2 781 bp（Genbank登錄號分別為：MT375608， MT375609， MT375610， MT375611），兩兩間序列的相似性均在90%以上。

進一步分析4個分離物的分子特征發(fā)現(xiàn)，4個分離物均為單鏈閉合環(huán)狀DNA，編碼6個開放閱讀框（open reading frame， ORF）。其中病毒鏈編碼AV1[外殼蛋白（coat protein， CP）， BS-1： 303-1 079 nt; BS-2和BS-4： 308-1 084 nt; BS-3： 302-1 078 nt]和AV2[移動蛋白（movement protein， MP）， BS-1： 143-493 nt; BS-2：148-498 nt; BS-3： 142-492 nt; BS-4： 148-477 nt]，互補鏈編碼AC1[復(fù)制蛋白（replication protein， Rep）， BS-1： 1 537-2 610 nt; BS-2和BS-4： 1 542-2615 nt; BS-3： 1 536-2 615 nt]、AC2[轉(zhuǎn)錄激活蛋白 （transcription activator protein， TrAP）， BS-1： 1 221-1 628 nt; BS-2和BS-4： 1 226-1 633 nt; BS-3： 1 220-1 627 nt]、AC3[復(fù)制增強蛋白，（replication enhancer）， BS-1： 1 076-1 480 nt; BS-2和BS-4： 1 081-1 485 nt; BS-3： 1 075-1 479 nt]和AC4[癥狀決定因子（possibly determining symptom expression），BS-1： 2 166-2 459 nt; BS-2和BS-4： 2 171-2 464 nt; BS-3： 2 168-2 464 nt]。在基因AV2 與ACl 之間有278-313 nts （BS-1：142-2 611 nt; BS-2和BS-4：147-2 616 nt; BS-3：141-2 616 nt）的基因間隔區(qū)（intergenic region， IR），其中包含雙生病毒復(fù)制起始相關(guān)的保守序列TAATATTAC。

將本研究中獲得的基因序列與NCBI中已登錄的序列進行比對分析發(fā)現(xiàn)，廣西百色市的4個番茄分離物與GenBank中已登錄的各TYLCV分離物具有較高的核苷酸相似性。進一步利用SDT軟件進行比對分析發(fā)現(xiàn)，廣西分離物（除BS3）的核苷酸序列與用于分析的TYLCV分離物的核苷酸序列的相似性均在91%以上。BS3與TYLCV-Iran和TYLACV-Abadeh的核苷酸相似性低于89%，與其余39個分離物的相似性均達到91%以上（圖2）。

2.3 TYLCV廣西分離物的進化分析

為了分析TYLCV廣西分離物與已報道的TYLCV各分離物的親緣關(guān)系，利用MEGA 7.0將廣西分離物與41個TYLCV分離物構(gòu)建了進化樹（圖3）。從圖中可以看出，廣西分離物BS-2和BS-4與部分國內(nèi)分離物處于一個大的分支，與湖南的分離物TYLCV-Hunan （KY783940）則處于一個小的分支，說明BS-2和BS-4與湖南分離物TYLCV-Hunan親緣關(guān)系最近;BS-1和BS-3則與云南分離物TYLCV-YN6553（MN503153）處于一個獨立的小分支，說明BS-1和BS-3與YN6553親緣關(guān)系最近。

3 討論

TYLCV在世界各地有報道[1-3]，自2006年起我國20多個省市先后有該病毒侵染番茄的報道[4-23]。本研究利用PCR、RCA及基因克隆等方法檢測、擴增出侵染廣西番茄的4個雙生病毒的全基因序列，通過分析各基因序列的分子特征及核苷酸相似性，證實4個病毒分離物的全基因序列分別為 2 776 bp（BS-1）、2 781 bp（BS-2）、2 752 bp（BS-3）、2 781 bp（BS-4），4個廣西分離物與39個已報道的TYLCV的核苷酸相似性均大于91%，依據(jù)目前國際雙生病毒分類標準[28]，確認這4個病毒分離物是TYLCV的分離物，加上之前檢測到的5種雙生病毒，侵染廣西番茄的雙生病毒至少有6種，從而加深了我們對廣西番茄黃化曲葉病毒病復(fù)雜性和防控難度的認識。

自1995年首次報道雙生病毒侵染番茄以來，本課題組對發(fā)生于廣西的雙生病毒進行了持續(xù)監(jiān)測。本研究證實TYLCV侵染廣西的番茄，而通過對4個TYLCV廣西分離物的進化關(guān)系進行分析發(fā)現(xiàn)，TYLCV與云南、湖南兩地的2個分離物的親緣關(guān)系最近，可能具有相同的進化來源。煙粉虱的遷徙、種苗的調(diào)運及蔬菜作物的長距離販運可能是該病毒遷入的主要途徑。有研究表明，TYLCV可通過種子進行傳播[29]，侵染廣西的TYLCV是否是通過種子調(diào)運進入的仍待進一步研究證實。

廣西地處亞熱帶地區(qū)，勝紅薊Ageratum conyzoides等多種雜草寄主以及番茄和各種瓜類等作物可周年生長，為介體昆蟲煙粉虱滋生繁衍和番茄黃化曲葉病毒病的傳播提供了便利條件。建議今后加強番茄抗病品種選育和評價研究，選育出兼抗TYLCV等多種雙生病毒的廣譜抗性品種。防治上要同時抓好無病壯苗培育，使用40目防蟲網(wǎng)覆蓋育苗苗床，遠離或清除番木瓜Carica papaya等主要寄主植物;利用粘蟲黃板或化學殺蟲劑定期噴殺傳毒介體-煙粉虱，減少傳播介體;清除勝紅薊等中間寄主，減少初侵染源;適當調(diào)整播植期，避開病毒高發(fā)期。

參考文獻

[1] MORIONES E， NAVAS-CASTILLO J. Tomato yellow leaf curl virus， an emerging virus complex causing epidemics worldwide [J]. Virus Research， 2000， 71（1/2）： 123-134.

[2] PIC B， DEZ M J， NUEZ F. Viral diseases causing the greatest economic losses to the tomato crop. II. The Tomato yellow leaf curl virus a review [J]. Scientia Horticulturae. 1996， 63（3/4）： 151-196.

[3] PRASAD A， SHARMA N， HARI-GOWTHEM G， et al. Tomato yellow leaf curl virus： impact， challenges， and management [J]. Trends in Plant Science， 2020， 25（9）：897-911.

[4] WU J B， DAI F M， ZHOU X P. First report of Tomato yellow leaf curl virus in China [J]. Plant Disease， 2006， 90（10）： 1359.

[5] 宋晰， 師迎春， 張世晨， 等. 北京地區(qū)番茄黃化曲葉病病毒分離物測定及株系的初步鑒定[J]. 植物病理學報， 2013， 43（2）： 113-119.

[6] 張愛紅， 楊菲， 潘陽， 等. 河北省番茄黃化曲葉病毒和番茄褪綠病毒復(fù)合侵染及分布[J]. 植物病理學報， 2019， 49（2）： 271-275.

[7] 王祥， 李剛， 趙黎明， 等. 吉林番茄黃化曲葉病毒分離物的檢測及其DNA-A全基因組序列分析[J]. 植物保護， 2014， 40（2）： 76-80.

[8] 阮濤， 楊會房， 楊水英， 等. 分離自陜西涇陽番茄的番茄黃化曲葉病毒（TYLCD）的分子特征[J].農(nóng)學與生物技術(shù)學報， 2013， 21（1）： 97-105.

[9] 金鳳媚， 薛俊， 郟艷紅， 等. 天津地區(qū)番茄黃化曲葉病毒DNA-A的克隆和序列分析[J]. 華北農(nóng)學報， 2011， 26（1）： 58-62.

[10]于云奇， 阮濤， 楊水英， 等. 河南省番茄黃化曲葉病病原分子鑒定及全基因組序列分析[J]. 西南大學學報（自然科學版）， 2014， 36（1）： 13-17.

[11]袁偉， 萬紅建， 王榮青， 等. 浙江省番茄黃化曲葉病毒的分子鑒定及序列分析[J]. 分子植物育種， 2013， 11（2）： 185-192.

[12]季英華， 熊如意， 程兆榜， 等. 江蘇省番茄黃化曲葉病的病原分子診斷[J]. 園藝學報， 2008， 35（12）： 1815-1818.

[13]韓暢， 張興旺， 高國龍， 等. 新疆番茄黃化曲葉病毒與煙粉虱隱種的區(qū)域分布檢測[J]. 石河子大學學報（自然科學版）， 2020， 38（2）：160-165.

[14]褚棟， 侯麗霞， 劉國霞， 等. 山東省局部地區(qū)番茄黃化曲葉病毒的分子鑒定[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學， 2010（2）： 13-15.

[15]丁菲， 王前， 蔣磊， 等. 安徽淮北番茄曲葉病的病原鑒定初報[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學學報， 2010， 37（3）： 421-424.

[16]張前榮， 溫慶放， 李大忠， 等. 福建省番茄黃化曲葉病毒的分子鑒定分析[J]. 福建農(nóng)業(yè)學報， 2016， 31（6）： 611-615.

[17]魯清華， 張宇， 張松柏， 等. 湖南省長沙市番茄黃化曲葉病毒的檢測與系統(tǒng)發(fā)育分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學報， 2018， 49（7）： 1332-1337.

[18]劉微， 史曉斌， 唐鑫， 等. 云南番茄褪綠病毒和番茄黃化曲葉病毒復(fù)合侵染的分子鑒定[J]. 園藝學報， 2018， 45（3）： 552-560.

[19]郝浩永， 滕紅梅， 劉縉， 等. 山西省運城市番茄黃化曲葉病毒的分子鑒定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學， 2018， 46（19）： 25-30.

[20]周瑩， 李興紅， 劉建華， 等. 河北省番茄黃化曲葉病毒病的分子鑒定初報[J]. 植物保護， 2010， 36（1）： 60-64.

[21]李春雷， 文朝慧， 王溪橋， 等. 白銀市番茄黃化曲葉病毒的鑒定[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)科技， 2015（3）： 39-40.

[22]湯亞飛， 佘小漫， 李正剛， 等. 廣東省番茄黃化曲葉病毒的分子鑒定及序列分析[J]. 植物保護， 2019， 45（4）： 143-148.

[23]湯亞飛， 張麗， 李正剛， 等. 海南省番茄黃化曲葉病病原的鑒定[C]∥中國植物病理學會2019年學術(shù)年會論文集， 成都： 中國農(nóng)業(yè)科學技術(shù)出版社， 2019.

[24]李戰(zhàn)彪， 徐鵬超， 秦碧霞， 等. 廣西番茄煙粉虱傳雙生病毒的分布及遺傳多樣性分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學報， 2017， 48（1）： 72-81.

[25]XU Youping， CAI Xinzhong， ZHOU Xueping. Tomato leaf curl Guangxi virus is a distinct monopartite begomovirus species [J]. European Journal of plant Pathology， 2007， 118（3）： 287-294.

[26]何自福， 虞皓， 羅方芳. 番茄煙粉虱傳雙生病毒PCR檢測[J]. 中國病毒學， 2004， 19（1）： 67-69.

[27]WYATT S D. Detection of subgroup III Geminivirus isolates in leaf extracts by degenerate primers and polymerase chain reaction [J]. Phytopathology， 1996， 86（12）： 1288-1293.

[28]KIL E J， KIM S， LEE Y， et al. Tomato yellow leaf curl virus （TYLCV-IL）： a seed-transmissible geminivirus in tomatoes[J/OL]. Scientific Reports， 2016， 6（1）： 19013. DOI： 10.1038/srep19013.

[29]BROWN J K， ZERBINI F M， NAVAS-CASTILLO J， et al. Revision of Begomovirus taxonomy based on pairwise sequence comparisions [J]. Archives of Virology， 2015， 160（6）： 1593-1619.

（責任編輯：楊明麗）