丁陽，王利

（1.上海市普陀區(qū)利群醫(yī)院，上海 200333；2.上海市中醫(yī)醫(yī)院，上海 200071）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是2型糖尿?。═ype 2 Diabetes，T2DM）常見的微血管病變，20%～40%糖尿病患者合并DN，嚴(yán)重影響糖尿病患者生存預(yù)后［1］，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，已成為國內(nèi)外終末期腎臟病的首要原因［2］。足細(xì)胞是腎小球基底膜的高度分化上皮細(xì)胞，在DN 發(fā)生發(fā)展過程中有關(guān)鍵作用。中藥防治足細(xì)胞損傷具有多途徑、多靶點優(yōu)勢。深入研究足細(xì)胞損傷機(jī)制，探尋中藥干預(yù)足細(xì)胞損傷靶點與途徑，能為明確DN 發(fā)病機(jī)制和DN 臨床干預(yù)治療提供新的思路。

研究指出，鐵死亡（Ferroptosis）在DN發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［3］。尤其是鐵死亡相關(guān)機(jī)制，如氧化應(yīng)激與DN 的病理特征存在較多共性，故鐵死亡在DN 的發(fā)生、發(fā)展中的重要作用越發(fā)為人們所重視，成為DN 臨床治療和相關(guān)藥物研發(fā)的一個新興靶點。番瀉苷A（Sennoside A，SA）是大黃的有效成分之一，研究已證實SA 可治療T2DM［4-5］。但其具體作用機(jī)制尚未闡明。因此本研究以鐵死亡為切入點，探究SA 治療DN 的分子機(jī)制。

1 材料

1.1 試驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境

C57BL/6J 小鼠，SPF 級，雄性，體質(zhì)量16～18 g，45 只，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SYXK（滬）2020－0009SCXK。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度為（23 ± 2）℃，濕度為60%～65%，自動光－暗控制（LD12：12，即7：00—19：00 光照，19：00—次日7：00暗置）。

1.2 主要儀器

光學(xué)顯微鏡（BX53，Olympus，日本）；血糖測試儀（三諾+Voice）；37 ℃烘箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司，型號DGX－9003B）；冰凍切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司，型號RM2016）；多功能酶標(biāo)儀（BioTek Synergy 2，Gene Company Limited）；Western 電泳儀及水平電泳槽，快速高效轉(zhuǎn)印濾紙，免疫印跡轉(zhuǎn)印墊（BIO－RAD，043BR41664）；分析天平（Sartorius anglytic，910324）；恒溫磁力攪拌器（81－2 型，上海司樂儀器有限公司）；脫色搖床（TS－1 型，江蘇海門市其林貝爾儀器有限公司）；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國，ProteinSimple）；電熱恒溫水槽（DK－8D）；超細(xì)勻漿機(jī)（F6/10，上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司）。

1.3 藥物及試劑

鏈脲佐菌素：S0130（Sigma）；番瀉苷A：B20380（上海源葉生物科技有限公司）；RIPA 裂解液：P0013C（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；SDS－PAGE 蛋白上樣緩沖液（5 ×）：P0015（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；蛋白酶抑制劑Cocktail（不含EDTA，100 × DMSO儲液）：B14002（Bimake）；ABC Kit（mouse IgG）：PK－6102（Vector）；ABC Kit（Rabbit IgG）：PK－6101（Vec?tor）；Vectorlabs DAB Substrate Kit：SK－4100（Vector）；anti－rabbit IgGAlexa Fluor 488：A27034（Invitrogen）；anti－rat IgGAlexa Fluor 594：A－11007（Invitrogen）；Beta Actin Antibody Mouse Monoclonal：66009－1－Ig（Proteintech）；GAPDH Antibody Mouse Monoclonal：60004－1－Ig（Proteintech）；BCA kit：A53226（Thermo Fisher）；NRF2 Polyclonal Antibody：16396－1－AP（Pro?teintech）；HMOX1 Polyclonal Antibody：27282－1－AP（Proteintech）；PTGS2 Monoclonal Antibody：266351－1－Ig （Proteintech） ；GPX4 Monoclonal Antibody：67763－1－Ig（Proteintech）；高脂飼料（20% Protein，20%Carbohydrate，60%Fat）：D12492（Research Diets）。

2 方法

2.1 動物模型分組及給藥

45 只6 周齡雄性C57BL/6J 小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按照隨機(jī)分組的方法，分為正常對照組10 只，高脂飲食組35 只。正常對照組給予普通飼料，高脂飲食組給予高脂飼料，連續(xù)喂養(yǎng)4 周后，高脂飲食組小鼠隔夜禁食、不禁水，腹腔注射STZ（100 mg/kg）；給藥3 d后小鼠斷尾取血，血糖值≥16.7 mmol/L判定為糖尿病造模成功；并收集尿液，以尿微量白蛋白>30 mg/L 判斷為DN 造模成功。本次DN 模型成功20只，隨機(jī)分成模型組10 只，番瀉苷A（SA）組10 只。SA 組給予SA 腹腔注射，30 mg/kg，4 周。在此期間模型組、SA 組繼續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)4 周。給藥結(jié)束后收集各組小鼠尿液，每組隨機(jī)選取5 只小鼠麻醉灌流后取腎組織放入10%多聚甲醛后以備免疫組化實驗。每組另外5 只小鼠取新鮮腎組織放入液氮保存以備后續(xù)實驗。

2.2 尿蛋白測定

給藥結(jié)束后收集各組小鼠尿液，考馬斯亮藍(lán)法檢測尿蛋白。

2.3 丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）水平的測定

腎組織勻漿：取適量的腎組織，稱重，在預(yù)冷的PBS 里清洗去除血液，將組織剪成小塊，放入研磨管中，檢測MDA 和GSH 時在研磨管中加入RIPA 裂解液（質(zhì)量體積比= 1∶20），進(jìn)行手工勻漿，以上操作都在冰上進(jìn)行。將制備的好的勻漿液10 000 ×g離心20 min，取上清液分裝至做好標(biāo)記的EP 管中用于檢測，BCA法檢測總蛋白濃度。根據(jù)MDA和GSH檢測試劑盒說明書分別檢測各組腎組織MDA和GSH的含量。

2.4 PTGS2檢測

冰凍切片，0.01 mol/L PBS 溶液漂洗3 次，每次5 min。4%PA 溶液室溫固定10 min，PBS 溶液漂洗3次后用檸檬酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，3%雙氧水孵育后用PBS 洗滌，加入PTGS2 抗體4 ℃孵育過夜，PBS 洗滌后加入二抗室溫孵育2 h，洗滌后用DAB 顯色，洗滌后脫水封片。顯微鏡下觀察，免疫組化陽性細(xì)胞呈棕黃色，采用圖像軟件分析測定陽性細(xì)胞平均光密度的表達(dá)。

2.5 鐵死亡相關(guān)指標(biāo)測定

Western Blot 檢測：BCA 試劑盒蛋白定量后，通過SDS－PAGE 凝膠電泳對蛋白樣品進(jìn)行分離后即轉(zhuǎn)移至乙醇活化后的PVDF 膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，1 × TBST 漂洗3 次，每次10 min；辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h，1 × TBST 漂洗3 次后，ECL 顯影。蛋白條帶使用ImageJ 進(jìn)行灰度分析，以β－actin 為內(nèi)參基因計算各組蛋白的相對表達(dá)水平。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠尿蛋白水平

模型組尿蛋白水平較正常對照組升高（P <0.01），SA 組尿蛋白水平較模型組降低（P< 0.01）。見表1。

表1 各組小鼠尿蛋白水平比較（±s）

表1 各組小鼠尿蛋白水平比較（±s）

注：與正常對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。

組別正常對照組模型組SA組n 10 10 10尿蛋白/（mg/dL）7.65±2.13 63.74±18.31**20.25±6.35##

3.2 各組小鼠氧化應(yīng)激變化情況

實驗結(jié)果顯示，模型組較正常對照組小鼠GSH 活性明顯降低（P<0.001），而MDA 水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）；SA 組與模型組比較，MDA水平顯著降低（P<0.01），而GSH 活性明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見表2。

表2 各組小鼠MDA、GSH變化情況比較（±s）

表2 各組小鼠MDA、GSH變化情況比較（±s）

注：與正常對照組比較，***P<0.001；與模型組比較，##P<0.01。

組別正常對照組模型組SA組n5 5 5 MDA（nmol/mg prot）5.30±1.32 11.82±2.91***6.82±2.52##GSH（mg/g prot）7.11±0.96 3.01±0.66***5.05±1.42##

3.3 鐵死亡標(biāo)志基因PTGS2細(xì)胞表達(dá)變化

采用DAB 染色，標(biāo)記各組小鼠PTGS2 的細(xì)胞表達(dá)。結(jié)果顯示，SA 能顯著降低PTGS2+表達(dá)（P<0.01），提示SA 能夠有效抑制DN 足細(xì)胞鐵死亡。見圖1和表3。

圖1 各組小鼠PTGS2陽性細(xì)胞表達(dá)（DAB染色，標(biāo)尺100 μm）

表3 各組小鼠PTGS2+陽性細(xì)胞表達(dá)（±s）

表3 各組小鼠PTGS2+陽性細(xì)胞表達(dá)（±s）

注：與正常對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。

組別正常對照組模型組SA組n5 5 5 PTGS2+陽性細(xì)胞287.67±29.78 2 383±196.35**1 272.67±284.44##

3.4 鐵死亡相關(guān)指標(biāo)的變化情況

采用Western Blot 檢測Nrf2、HMOX－1 及GPX4 蛋白表達(dá)。實驗結(jié)果顯示，SA 能降低DN 小鼠Nrf2 和HMOX－1 蛋白的表達(dá)（P< 0.05），增加GPX4 蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.05）。結(jié)果提示：SA 對Nrf2、HMOX－1 的抑制可減輕鐵死亡，對Nrf2/HMOX－1 介導(dǎo)的鐵死亡的干預(yù)可能是SA 發(fā)揮對DN治療作用的重要機(jī)制。見表4和圖2。

圖2 各組小鼠Nrf2、HMOX－1、GPX4蛋白表達(dá)

表4 各組小鼠Nrf2、HMOX－1、GPX4蛋白含量比較（±s）

表4 各組小鼠Nrf2、HMOX－1、GPX4蛋白含量比較（±s）

注：與正常對照組比較，***P<0.001；與模型組比較，#P<0.05。

組別正常對照組模型組SA組Nrf2/β－actin 0.302±0.087 0.853±0.067***0.582±0.079#HMOX－1/β－actin 0.208±0.084 0.887±0.068***0.558±0.053#GPX4/β－actin 0.853±0.067 0.209±0.084***0.582±0.079#

4 討論

糖尿病腎?。―N）的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其病理、生理機(jī)制目前仍不明確。研究證實，鐵死亡是一種鐵依賴性的、以脂質(zhì)過氧化物累積為特征的細(xì)胞死亡新形式。鐵離子蓄積、GSH 耗竭引起的氧化應(yīng)激失衡及脂質(zhì)過氧化成為誘發(fā)DN 足細(xì)胞鐵死亡的三個重要機(jī)制。谷胱甘肽（glutathione，GSH）的合成及還原作用是氨基酸代謝途徑調(diào)控鐵死亡的核心機(jī)制，GSH 含量不足將無法代謝由于氧化應(yīng)激而產(chǎn)生的過氧化脂類。胱氨酸－谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運體（系統(tǒng)xc－）的紊亂會導(dǎo)致谷胱甘肽過氧化酶4（Glutathione peroxidase 4，GPX4）失活，脂質(zhì)氧化物不能經(jīng)過GPX4 催化的谷胱甘肽還原酶反應(yīng)代謝，繼而發(fā)生類似Fenton 反應(yīng)的方式氧化脂質(zhì)產(chǎn)生大量的活性氧［6］。脂質(zhì)過氧化使細(xì)胞膜的流動性和通透性發(fā)生變化，最終導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的變化，其主要產(chǎn)物是丙二醛（malondialdehyde，MDA）和硫代巴比妥酸。因此，可通過檢測MDA 含量的變化了解膜脂過氧化的程度［7］。

HMOX－1是催化血紅素分解代謝酶的關(guān)鍵酶，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鐵代謝過程及細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)［8］。HMOX－1 表達(dá)或活性增高引起鐵離子聚集是引發(fā)鐵死亡的重要機(jī)制［9］。進(jìn)一步的文獻(xiàn)調(diào)研顯示，HMOX－1 是核因子E2 相關(guān)因子2（NF－E2－related factor2，Nrf2）下游的重要靶基因。Nrf2 是啟動細(xì)胞抗氧化通路的主要轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控包括HMOX－1在內(nèi)的下游靶基因參與細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激過程［10］。以往的研究認(rèn)為Nrf2/HMOX－1 途經(jīng)的上調(diào)具有細(xì)胞保護(hù)作用，但越來越多的研究顯示，Nrf2/HMOX－1 途經(jīng)的過度激活是介導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡的重要機(jī)制［9］。

本研究實驗結(jié)果顯示，DN 模型小鼠Nrf2、HMOX－1 以及鐵死亡標(biāo)志基因PTGS2 的蛋白表達(dá)顯著增高，谷胱甘肽還原系統(tǒng)關(guān)鍵酶GPX4 表達(dá)顯著降低。SA 干預(yù)則能夠顯著改善氧化應(yīng)激反應(yīng)（降低MDA 水平，提高GSH 活性），降低Nrf2、HMOX－1 及PTGS2蛋白表達(dá)。這提示SA可以抑制DN足細(xì)胞鐵死亡，推測其作用與調(diào)控Nrf2/HMOX－1 通路介導(dǎo)的鐵死亡有關(guān)。但其詳細(xì)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。