辜雷燕 郭麗娟 劉晴蓉 李宇豪 李婧瑜 黃寧

（四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，四川 成都 610041）

許多信號(hào)，例如內(nèi)毒素、細(xì)胞因子等，與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合后，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終會(huì)轉(zhuǎn)入核內(nèi)誘導(dǎo)相應(yīng)靶基因表達(dá)，從而表現(xiàn)出相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，如巨噬細(xì)胞的極化等。真核細(xì)胞中，由于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核被細(xì)胞核雙層核模系統(tǒng)隔開[1]，信號(hào)分子跨核膜轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)細(xì)胞功能的發(fā)揮至關(guān)重要[2]。核轉(zhuǎn)位通路的基本結(jié)構(gòu)主要有三個(gè)：一是具有“分子篩”功能的核孔蛋白復(fù)合體（Nuclear pore complex, NPC），在NPC上存在靶蛋白與核轉(zhuǎn)位受體的結(jié)合位點(diǎn)[3]；二是核轉(zhuǎn)運(yùn)受體；三是核轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)[4]。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)是細(xì)胞外配體反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子，在胞質(zhì)中被Janus激酶磷酸化、形成二聚體，然后跨過(guò)核膜轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核作用于靶基因，介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化等多種生物學(xué)過(guò)程[5-6]。因此，檢測(cè)STAT這一類核轉(zhuǎn)位分子的胞質(zhì)、胞核的分布，對(duì)研究相關(guān)信號(hào)通路及細(xì)胞活動(dòng)等十分重要。

研究核轉(zhuǎn)位蛋白的核質(zhì)分布變化常采用核質(zhì)蛋白分離-WB的方法。其中核質(zhì)蛋白分離常用的方法是兩步裂解離心法，即先用破膜離心分離胞質(zhì)蛋白（上清）和細(xì)胞核（沉淀），再次裂解細(xì)胞核得到核蛋白[7]。然而不同細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)條件不盡相同，現(xiàn)有的分離條件對(duì)巨噬細(xì)胞核質(zhì)分離效果不佳，這對(duì)開展核轉(zhuǎn)位分子如STAT6的信號(hào)通路的相關(guān)研究造成一定限制。因此，本研究采用不同裂解液、裂解時(shí)間及離心條件，探究巨噬細(xì)胞系RAW264.7的核質(zhì)蛋白分離的最佳條件。同時(shí)，選取STAT6作為核轉(zhuǎn)位信號(hào)分子的具體對(duì)象，驗(yàn)證優(yōu)化后的核質(zhì)蛋白分離條件是否可以成為研究核轉(zhuǎn)位分子的適用條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7購(gòu)自上海中科院細(xì)胞中心，培養(yǎng)在含10%(v /v )滅活胎牛血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為溫度37 ℃，二氧化碳濃度5 %。

1.1.2 試劑

核質(zhì)分離試劑盒（Solarbio公司，產(chǎn)品編號(hào)為R0050）；RLN裂解液的主要成分為50 mmol·L-1Tris-HCl（pH 7.4）、140 mmol·L-1NaCl、0.5% Nonidet P-40（1.06 g·mL-1）和1.5 mmol·L-1MgCl2。RIPA裂解液的主要成分為50 mmol·L-1Tris-HCI（pH 7.4）、150mmol·L-1NaCl、1% Triton X-100、1% 脫氧膽酸鈉、0.1% SDS和1 mmol·L-1EDTA（pH 8.0）；抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH，胞質(zhì)蛋白內(nèi)參）抗體（產(chǎn)品貨號(hào)#5174S）、抗組蛋白3（Histone 3，H3，核蛋白內(nèi)參）抗體（產(chǎn)品貨號(hào)#4499S）、抗STAT6抗體（產(chǎn)品貨號(hào)#53975）購(gòu)自Cell Signaling公司。

1.2 方法

1.2.1 胞質(zhì)蛋白的提取

取出正常培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞，吸去殘留培養(yǎng)基后，加入預(yù)冷PBS清洗1-2次，再加入2-3 mL預(yù)冷的PBS，將細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液后，每50萬(wàn)個(gè)細(xì)胞為一份，500 g離心5 min去上清，加入200 μL RLN裂解液或試劑盒的漿蛋白抽提試劑（均提前加入PMSF和蛋白酶抑制劑（Protein inhibitor，PI），將細(xì)胞懸液置于冰上裂解。裂解時(shí)間包括0、1、2、3、5、10 min；而后在4 ℃進(jìn)行離心，離心力為6000或12000 g，離心時(shí)間包括3、5、10 min。收集上清為胞質(zhì)蛋白，存于-80 ℃待檢測(cè)。

1.2.2 胞核蛋白的提取

將1.2.1中得到的細(xì)胞核用預(yù)冷的PBS洗滌兩次，每次6000 g離心10 min，棄上清。然后在管中加入200 μL RIPA裂解液（含PMSF和PI），然后進(jìn)行超聲破碎，每次超聲破碎5 s，間歇5 s，共三次，溶液均質(zhì)化后，4 ℃，12000 g離心20 min，取上清即為核蛋白，存于-80℃待檢測(cè)。

1.2.3 WB檢測(cè)

將上述提取的胞質(zhì)蛋白和胞核蛋白經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（細(xì)胞核蛋白上樣量為5 μL，細(xì)胞質(zhì)蛋白上樣量為10 μL）后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，脫脂牛奶封閉后，以細(xì)胞質(zhì)蛋白GAPDH和核蛋白H3抗體為一抗，以相應(yīng)來(lái)源二抗進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。

采用核質(zhì)分離的最佳條件，按照上述步驟分離RAW264.7細(xì)胞的胞質(zhì)、胞核蛋白，利用STAT6抗體進(jìn)行WB檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 分離條件初探

首先我們采用目前流行的條件（即試劑盒說(shuō)明書條件）分離核質(zhì)蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)自制RLN裂解液和試劑盒的漿蛋白抽提試劑處理后，胞核蛋白H3在分離的胞質(zhì)組分中大量存在，沒(méi)有達(dá)到核質(zhì)分離的效果，且不同裂解時(shí)間（5或10 min）之間沒(méi)有明顯差異（圖1A）；這說(shuō)明目前采用的裂解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

接下來(lái)，我們檢測(cè)裂解0 min時(shí)的分離效果，如圖1B所示，兩種裂解液處理后，不論離心時(shí)間長(zhǎng)短，胞核組分中檢測(cè)到大量H3，但胞質(zhì)組分中仍然有較明顯的H3條帶；這說(shuō)明分離條件有待繼續(xù)優(yōu)化。

圖1 不同裂解時(shí)間、離心條件下，初探胞質(zhì)/胞核分離效果。

2.2 裂解1-3 min的分離效果

接著，我們檢測(cè)了裂解1、2、3 min時(shí)的分離效果。如圖2和圖3所示，裂解1 min和2 min時(shí)，自制裂解液組中，不論離心時(shí)間長(zhǎng)短，核組分（N）中能檢測(cè)到大量H3，但胞質(zhì)組分中仍能檢測(cè)到少量H3；在試劑盒試劑組中，各個(gè)離心條件的胞質(zhì)組分的H3（C-H3）條帶都很弱，甚至檢測(cè)不到，且隨著離心時(shí)間的增加，C-H3條帶越弱。如圖4所示，裂解3 min時(shí)，自制裂解液組的CH3條帶非常微弱，甚至不可見；相反，試劑盒組的C-H3條帶卻比圖2和圖3中明顯一些。

圖2 裂解1min時(shí)，不同離心條件下胞質(zhì)/胞核分離效果。

圖3 裂解2 min時(shí)，不同離心條件下胞質(zhì)/胞核分離效果。

圖4 裂解3 min時(shí)，不同離心條件下胞質(zhì)/胞核分離效果。

這些結(jié)果表明，對(duì)自制裂解液RLN來(lái)說(shuō)，最佳分離條件是裂解3 min，離心力6000 g，10 min；

對(duì)試劑盒來(lái)說(shuō)，最佳分離條件是裂解1-2 min，離 心力6000-12000 g，10 min。

2.3 STAT6的核質(zhì)分布

有文獻(xiàn)表明，STAT6在靜息狀態(tài)下主要存在于巨噬細(xì)胞的胞質(zhì)中［8］。因此，我們用試劑盒試劑，按照上述最優(yōu)的條件，即裂解1或2 min，離心力6000或12000g，10 min的條件分離RAW264.7細(xì)胞的核質(zhì)，對(duì)STAT6在巨噬細(xì)胞核質(zhì)中的分布情況進(jìn)行驗(yàn)證。如圖5所示，每個(gè)條件下C-H3條帶都很弱，且以裂解1 min效果更佳；此時(shí)，胞質(zhì)組分能檢測(cè)到大量STAT6，而胞核組分中僅檢測(cè)到少量STAT6。

圖5 最優(yōu)分離條件下STAT6蛋白核質(zhì)表達(dá)檢測(cè)

3 討論

細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控在分子細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域一直是研究的熱點(diǎn)。許多蛋白由胞漿進(jìn)入細(xì)胞核的入核轉(zhuǎn)運(yùn)或逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，是整個(gè)信號(hào)途徑傳遞的一個(gè)非常重要的調(diào)控點(diǎn)［9］。采用WB法檢測(cè)蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的差異性表達(dá)有助于研究該分子進(jìn)行核轉(zhuǎn)位的情況。因此，核質(zhì)蛋白分離是研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)以及核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象的重要實(shí)驗(yàn)方法。然而，目前查閱到的核質(zhì)蛋白分離策略并沒(méi)有提供有效的分離細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白的方案，并不能很好地運(yùn)用該研究方法。

我們?cè)O(shè)置了裂解液、裂解時(shí)間、離心力、離心時(shí)間的不同變量進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在這些因素中，裂解時(shí)間和離心時(shí)間是影響核質(zhì)蛋白分離效果最顯著的因素，對(duì)巨噬細(xì)胞而言，最優(yōu)的條件是裂解1-3 min，離心10 min。裂解液的類型對(duì)分離效果影響較小，不過(guò)需注意不同的裂解液最佳的裂解時(shí)間有所差異。而在離心力高于一定程度（>6000 g）時(shí)，對(duì)分離效果的影響較小。在此實(shí)驗(yàn)條件的基礎(chǔ)上，我們對(duì)STAT6在巨噬細(xì)胞質(zhì)核分布進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果與他人的研究一致；這表明我們得出的分離核質(zhì)蛋白條件能有利于高效的進(jìn)行跨核信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究。

除了核質(zhì)分離-WB外，還可以采用免疫熒光檢測(cè)蛋白核質(zhì)分布。免疫熒光利用熒光標(biāo)記的抗體來(lái)檢測(cè)特定的靶抗原，原位標(biāo)記目的蛋白［10］。雖然它能顯示單個(gè)細(xì)胞中目的分子的核質(zhì)分布情況，但其具有熒光易淬滅、高背景及難準(zhǔn)確定量等缺點(diǎn)。與免疫熒光法相比，核質(zhì)分離-WB具有操作步驟較少、試劑設(shè)備要求較低、定量簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。因此我們的研究為簡(jiǎn)單方便的跨核分子研究提供了有力支持。

綜上所述，對(duì)于巨噬細(xì)胞來(lái)說(shuō)，采用漿蛋白裂解液在冰上裂解1-3 min，6000 g以上離心10 min一般能達(dá)到較為理想核漿蛋白分離效果，為進(jìn)一步的核轉(zhuǎn)位分子的研究打下良好基礎(chǔ)。