朱 風(fēng)，丁 榮，徐 浩，楊慶利，吳 薇，侯秀丹

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109)

農(nóng)藥殘留一直是食品安全領(lǐng)域關(guān)注的重要方面之一.目前，由于農(nóng)藥殘留污染食品引起的食物中毒人數(shù)已占食物中毒總?cè)藬?shù)的三分之一，其中有機(jī)磷農(nóng)藥是第一位.有機(jī)磷農(nóng)藥主要用于預(yù)防植物病害、昆蟲和雜草，過量使用容易殘留在食物或環(huán)境樣品上.殘留的農(nóng)藥侵入人體會(huì)引起頭痛、煩躁不安和呼吸困難癥狀[1]，長(zhǎng)期食用被污染的食品會(huì)導(dǎo)致癌癥甚至死亡[2-3].中國和其他國家規(guī)定了大多數(shù)有機(jī)磷農(nóng)藥的最大殘留限量不應(yīng)超過0.2 mg/kg或0.5 mg/kg[4].因此，食品中有機(jī)磷農(nóng)藥的精準(zhǔn)檢測(cè)和監(jiān)測(cè)對(duì)保證食品安全至關(guān)重要.

由于食品基質(zhì)的復(fù)雜性、成分的多樣性和痕量的殘留物，直接使用儀器檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥非常困難.通常，選擇使用合適的樣品前處理方法對(duì)其進(jìn)行分離和富集，可以提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性.傳統(tǒng)的液液萃取和固相萃取均存在有機(jī)溶劑消耗多且耗時(shí)的缺點(diǎn).近年來，基于新型材料的萃取方法常用于有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)，比如分散液-液微萃取[5]、分散固相萃取[6]、中空纖維液相微萃取、磁固相萃取[7]、超聲輔助乳化和液相微萃取[8]等.這些萃取方法縮短了萃取時(shí)間，減少了有機(jī)溶劑消耗.目前研究的新型材料主要集中在金屬有機(jī)骨架材料[9-10]、共價(jià)有機(jī)骨架材料[11]、離子液體[12-14]、分子印跡聚合物[15]和碳材料[16-18]等.

基于金屬網(wǎng)的吸附微萃取是一種新的萃取方法，已廣泛使用[19].大量的吸附材料可以被涂覆到金屬網(wǎng)的表面上，與分析物的接觸面積大大增加，并且萃取平衡相對(duì)較快，縮短了萃取時(shí)間.

石墨烯氣凝膠作為一種三維材料，自2013年問世以來，由于其超大的比表面積、出色的機(jī)械性能、高孔隙率和低密度而受到了越來越多的關(guān)注[20-23].在樣品前處理領(lǐng)域，被設(shè)計(jì)并制備成多孔且具有兩親性的吸附劑來吸附、萃取和預(yù)富集污染物[24-25].盡管石墨烯氣凝膠的三維框架結(jié)構(gòu)可以提供大量的吸附位點(diǎn)[25]，但其具有結(jié)構(gòu)單一的缺點(diǎn)，導(dǎo)致對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的吸附選擇性差.因此，為了實(shí)現(xiàn)復(fù)雜食品中痕量有機(jī)磷農(nóng)藥的高效富集，有必要制備改性的石墨烯氣凝膠以提高萃取性能.納米材料具有較大的比表面積、特殊的電子結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)，Au納米顆粒除具有其它納米材料的一些優(yōu)良的性質(zhì)外，還具有一個(gè)特殊的性質(zhì)[26]：帶有-S-的分子可以更好地吸附在Au納米顆粒的表面.

本工作將Au納米顆粒改性的氧化石墨烯氣凝膠修飾的金屬網(wǎng)(Au/GOA-SSM)作為萃取材料，整合了吸附萃取和氧化石墨烯氣凝膠吸附特性的優(yōu)點(diǎn).通過一系列的表征手段證明了該復(fù)合材料的成功合成，并優(yōu)化了與萃取工藝有關(guān)的相關(guān)參數(shù)，最后將該方法用于蔬菜中4種不同有機(jī)磷農(nóng)藥的分析檢測(cè).

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

SPE-80數(shù)控固相萃取儀(濟(jì)南海能儀器股份有限公司)；高效液相色譜儀(UltiMate3000，賽默飛世爾科技)，配有DAD檢測(cè)器和自動(dòng)進(jìn)樣器；JSM-6701F掃描電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社)；X射線光電子能譜儀(XPS，ESCALAB250Xi，美國).液相色譜使用C18色譜柱(HYpersil ODS2，250 mm × 4.6 mm × 5 μm)，流動(dòng)相由不同比例的甲醇和水組成，梯度洗脫：0～12 min，73%甲醇；12～13 min，73～78%甲醇；柱溫箱的溫度為25 ℃；流動(dòng)相的流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm.

不銹鋼金屬網(wǎng)(SUS304，孔74 μm，Φ50 μm)購自蕾蔻金屬制品公司(中國常州).石墨粉、辛硫磷、雙硫磷、倍硫磷、殺螟硫磷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、N-羥基琥珀酰亞胺、N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亞胺購自上海阿拉丁試劑公司.HAuCl4、檸檬酸三鈉購自上海麥克林生物化學(xué)有限公司(中國上海).商業(yè)萃取柱(C18，Carb，SAX，F(xiàn)lorisil，-NH2)和固相萃取空柱(3 mL)購自深圳生物通信生物技術(shù)有限公司(中國深圳).

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 萃取材料的制備

氧化石墨烯(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%)通過改良的Hummers方法制備得到[27].

Au納米顆粒的制備：將20 mL HAuCl4水溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%)在攪拌下加熱至沸騰，迅速加入0.4 mL檸檬酸三鈉水溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%)，繼續(xù)加熱至溶液變?yōu)榫萍t色，反應(yīng)15 min后停止加熱，攪拌狀態(tài)下自然冷卻至室溫，置于4 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆?

Au/GOA-SSM的制備過程如圖1所示.首先，將不銹鋼金屬網(wǎng)剪成直徑為8 mm圓形，浸入稀鹽酸中進(jìn)行刻蝕，干燥后，將其放入APTES中12 h以完成氨基的修飾.然后，將獲得的金屬網(wǎng)放入裝有4 mL氧化石墨烯懸浮液，0.001 gN-羥基琥珀酰亞胺和0.001 gN-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亞胺的5 mL離心管中，70 ℃下反應(yīng)2 h，將其轉(zhuǎn)移至冷凍干燥器(20 Pa，-50 ℃)中保持10 h，重復(fù)該過程3次以獲得所需厚度的涂層.干燥后，將其放入5 mL離心管中，加入制備的金溶膠，反應(yīng)2 h后停止，干燥后的Au/GOA-SSM置于室溫下儲(chǔ)存，備用.

圖1 Au/GOA-SSM的制備過程

1.2.2 樣品預(yù)處理和萃取過程

香菜購自當(dāng)?shù)氐某?中國青島).首先，使用高速粉碎機(jī)將香菜粉碎，將1 g香菜粉放入10 mL乙醇/水(體積比為70∶30)混合溶液中，在55 ℃搖動(dòng)萃取3 h.之后，將混合物離心除去香菜樣品并保留萃取劑，然后將萃取劑使用氮?dú)獯抵? mL，最后將其用超純水定容至20 mL，以進(jìn)行萃取.

萃取過程在自動(dòng)固相萃取儀上進(jìn)行.首先，將三片Au/GOA-SSM裝填到3 mL固相萃取空柱中，柱子的兩端通過兩個(gè)篩板進(jìn)行固定.填充的Au/GOA-SSM使用10 mL乙腈/水(體積比為1∶1)進(jìn)行活化預(yù)處理.將質(zhì)量濃度均為200 μg/L的4種有機(jī)磷農(nóng)藥的水溶液(20 mL)，以1.5 mL/min的流速進(jìn)樣到Au/GOA-SSM填充的固相萃取柱中，然后，使用0.5 mL水洗滌吸附劑，在空氣中干燥5 min后，使用洗脫液(1 mL乙腈)以0.8 mL/min的流速洗脫保留在吸附劑上的有機(jī)磷農(nóng)藥.最后，將得到的洗脫液直接用高效液相色譜進(jìn)行分析，三次重復(fù)測(cè)量以獲得平均值作為最終數(shù)據(jù).

2 結(jié)果與討論

2.1 材料表征

Au/GOA-SSM的表面形貌通過掃描電鏡在不同倍數(shù)下進(jìn)行表征.由圖2可見，金屬網(wǎng)的骨架結(jié)構(gòu)是由不銹鋼絲相互連接而成，并被氧化石墨烯氣凝膠所包裹，也可以明顯看到石墨烯的片層結(jié)構(gòu)和褶皺結(jié)構(gòu).通過X射線光電子能譜表征[圖2(C)]，Au/GOA-SSM表面出現(xiàn)Au元素，表明其成功合成.

圖2 (A, B) Au/GOA-SSM的掃描電鏡圖, (C) X射線光電子能譜圖

2.2 理論相互作用能

基于密度泛函理論，使用Gaussian09軟件對(duì)Au與4種有機(jī)磷農(nóng)藥分子之間的相互作用模型進(jìn)行調(diào)整和作用位點(diǎn)優(yōu)化，獲得了最合適的理論相互作用能，結(jié)果如表1所列.在理論計(jì)算過程中，考慮了它們之間的氫鍵、配位作用等參數(shù).由表1可見，具有P=O基團(tuán)的殺螟硫磷與Au納米粒子的結(jié)合能更高.

表 1 4種有機(jī)磷農(nóng)藥在金納米顆粒上的理論作用能及油水分配系數(shù)(log KOW)

2.3 條件優(yōu)化

本試驗(yàn)優(yōu)化了萃取和洗脫條件，包括進(jìn)樣體積、進(jìn)樣速率、洗脫劑類型、洗脫劑體積等.在優(yōu)化試驗(yàn)中，使用的有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為200 μg/L.

2.3.1 萃取條件

試驗(yàn)選擇了三片金屬網(wǎng)填充于固相萃取小柱中.因?yàn)槲絼┑奈搅坑邢?，所以本試?yàn)考察了不同的進(jìn)樣體積(10～60 mL)對(duì)回收率的影響，結(jié)果如圖3所示.由圖3(a)可見，當(dāng)樣品體積低于20 mL時(shí)，萃取回收率幾乎保持不變，之后萃取回收率逐漸降低，表明在20 mL時(shí)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡吸附.因此，20 mL為最佳進(jìn)樣體積.

進(jìn)樣速率從兩方面影響萃取效率.較高的進(jìn)樣速率可以節(jié)省操作時(shí)間，但由于分析物與萃取材料之間的接觸不足，易造成分析物流失.相反，較低的速率會(huì)導(dǎo)致在萃取材料和樣品溶液之間出現(xiàn)分析物的“反萃取”現(xiàn)象.如圖3(b)所示，隨著進(jìn)樣速率的增加，4種有機(jī)磷農(nóng)藥分子的回收率先升高后降低，因此，選擇1.0 mL/min作為樣品的進(jìn)樣速率.

2.3.2 洗脫條件

選擇合適的洗脫溶劑是提高萃取效率的最重要的方面，理想的洗脫劑可以將分析物從萃取材料表面完全洗脫下來.本工作研究了幾種常用的有機(jī)溶劑，包括甲醇、丙酮、乙腈等.圖3(c)顯示乙腈的萃取效率最高，因此將乙腈用于有機(jī)磷農(nóng)藥的洗脫.

在洗脫過程中，當(dāng)洗脫液流過萃取材料時(shí)，有必要探究最小的洗脫液體積，以保證分析物在完全解吸的條件下節(jié)省有機(jī)溶劑.如圖3(d)所示，分別研究了0.5、1.0、1.5 mL洗脫液.結(jié)果表明，1.0 mL洗脫液可以充分洗脫分析物.因此，使用1.0 mL乙腈對(duì)分析物進(jìn)行洗脫.

圖3 萃取和洗脫條件的優(yōu)化

2.4 萃取性能和萃取機(jī)制的研究

圖4(a)顯示了商用萃取材料(50 mg，SAX，C18，-NH2，F(xiàn)lorisil，Carb)和制備的萃取材料(Au/GOA-SSM)對(duì)4種有機(jī)磷農(nóng)藥的萃取回收率比較結(jié)果.由圖4(a)可以看出，與商用的萃取材料相比，Au/GOA-SSM呈現(xiàn)出明顯優(yōu)異的萃取性能.圖4(b)對(duì)比了不同有機(jī)磷農(nóng)藥的油水分配系數(shù)、理論吸附能和萃取回收率.由圖4(b)可見，其油水分配系數(shù)，即有機(jī)磷農(nóng)藥的親疏水性對(duì)萃取回收率的影響較大.

圖4 (a) 不同材料的萃取回收率比較, (b) 影響萃取性能的因素對(duì)比

2.5 方法學(xué)評(píng)估

在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下，對(duì)基于Au/GOA-SSM建立的固相萃取-高效液相色譜方法的分析性能進(jìn)行評(píng)估，包括線性范圍、檢測(cè)限、重復(fù)性和重現(xiàn)性等，結(jié)果如表2所列.由表2可見，辛硫磷和殺螟硫磷在1～200 μg/L范圍內(nèi)、雙硫磷和倍硫磷在0.5～200 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.990 6～0.998 9之間，檢測(cè)限均在0.2 μg/L以下，能滿足我國和其他國家最大限量檢測(cè)的要求.通過使用單根萃取柱從標(biāo)準(zhǔn)溶液中進(jìn)行5次連續(xù)萃取來探究該方法的精度，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.8%～5.6%之間.通過使用相同方法制備的5根萃取柱對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行萃取來探究萃取柱的重現(xiàn)性和方法的準(zhǔn)確度，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在5.9%～9.8%之間，可見建立的萃取方法對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥分子具有較高的萃取性能和良好的重復(fù)性.

表2 有機(jī)磷農(nóng)藥的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.6 實(shí)際樣品的應(yīng)用

為了探究所建立方法的實(shí)用性，將其應(yīng)用于香菜樣品中4種有機(jī)磷農(nóng)藥分子的測(cè)定，結(jié)果如表3所列、圖5所示.由圖5可見，在香菜樣品中未檢測(cè)到有機(jī)磷農(nóng)藥的存在.本試驗(yàn)進(jìn)一步通過加標(biāo)回收的方法，考察了樣品中基質(zhì)對(duì)所制備材料萃取性能的影響.在香菜樣品中分別加入質(zhì)量濃度為20、40、100 μg/L的有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液后進(jìn)行測(cè)定，由結(jié)果得其回收率在70.4%～97.7%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.9%～10.3%之間.

表3 香菜中有機(jī)磷農(nóng)藥的含量、加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

圖5 實(shí)際樣品以及加入20、40、100 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

3 結(jié)論

本研究通過化學(xué)鍵合、冷凍干燥、化學(xué)還原等一系列方法制備得到三維Au/GOA-SSM萃取材料，并應(yīng)用于蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)藥分子的萃取和檢測(cè).金屬網(wǎng)作為萃取基體，減少了氧化石墨烯的堆積，提高了Au納米顆粒的負(fù)載量.與商用的萃取材料相比，制備的此材料對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的萃取回收率明顯提高.該材料優(yōu)異的萃取性能歸因于氧化石墨烯氣凝膠的吸附性能、Au對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的選擇性吸附以及金屬網(wǎng)作為基體的通透性.建立的方法對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥呈現(xiàn)出較寬的線性范圍和較低的檢測(cè)限，具有簡(jiǎn)便、成本低和靈敏度高等優(yōu)勢(shì).將其用于香菜中有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)，未檢出.通過加標(biāo)回收率的考察，其結(jié)果均在70.4%～97.7%之間，可見該方法具有良好的適用性.