宋雪皎，谷淑波，高居榮

(作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 泰安 271018)

CIRAS-3光合儀是美國(guó)PP SYSTEMS公司生產(chǎn)的第三代光合測(cè)定系統(tǒng)，采用開(kāi)放式氣路系統(tǒng)和雙氣室紅外線(xiàn)氣體分析儀的原理，通過(guò)檢測(cè)植物光合作用過(guò)程中CO2和H2O的變化量來(lái)測(cè)得植物葉片的光合速率、蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度等相關(guān)參數(shù).與CIRAS-2型相比，該儀器在環(huán)境因子控制和光源控制等方面進(jìn)行了全面升級(jí)，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)學(xué)[1-2]、園藝[3]、林學(xué)[4]、植物生理[5-6]、植物生態(tài)[7]、植物病理[8]等相關(guān)研究領(lǐng)域.

由于CIRAS-3光合儀使用時(shí)，需要注意的事項(xiàng)較多，如果操作不當(dāng)，則可能導(dǎo)致測(cè)定數(shù)據(jù)難以穩(wěn)定或者偏差過(guò)大.為使初學(xué)者能夠快速掌握光合儀的正確操作方法，做到正確使用并獲取有效的光合數(shù)據(jù)，根據(jù)使用經(jīng)驗(yàn)，對(duì)光合儀的測(cè)試原理、操作方法、注意事項(xiàng)、維護(hù)和保養(yǎng)、常見(jiàn)問(wèn)題解決5個(gè)方面進(jìn)行研究總結(jié)，以期為使用者提供有效的參考和幫助，切實(shí)提高CIRAS-3光合儀的使用效益.

1 CIRAS-3光合儀測(cè)定原理和測(cè)定參數(shù)

1.1 CIRAS-3光合儀測(cè)定原理

CIRAS-3光合儀測(cè)定原理如圖1所示.從進(jìn)氣口通入流速穩(wěn)定的空氣，使未經(jīng)同化室的空氣作為參比氣進(jìn)入一個(gè)氣室，從同化室出來(lái)的空氣作為樣本氣進(jìn)入另一個(gè)氣室，由紅外監(jiān)測(cè)器檢測(cè)出參比氣和樣本氣的CO2和H2O濃度差，然后根據(jù)其濃度差、同化室中葉片面積和氣體流量計(jì)算出光合速率.

圖1 CIRAS-3光合儀工作原理

1.2 CIRAS-3光合儀測(cè)定參數(shù)

CIRAS-3光合儀測(cè)定參數(shù)有三種：一是直接測(cè)定參數(shù)，如凈光合速率、蒸騰速率等.二是測(cè)定環(huán)境參數(shù)，包括參比室內(nèi)CO2/H2O的濃度、環(huán)境相對(duì)濕度、葉片及葉室溫度等，可通過(guò)測(cè)定環(huán)境參數(shù)來(lái)判斷儀器工作狀態(tài)是否正常.三是可計(jì)算參數(shù)，是通過(guò)光合響應(yīng)曲線(xiàn)的測(cè)定而獲得的數(shù)據(jù)，包括光補(bǔ)償點(diǎn)、CO2補(bǔ)償點(diǎn)、飽和光強(qiáng)等(如表1所列).

表1 CIRAS-3光合儀測(cè)定參數(shù)

2 CIRAS-3光合儀操作方法

2.1 啟動(dòng)程序

按下ON/OFF電源開(kāi)關(guān)，藍(lán)色LED指示燈亮，約30 s主機(jī)屏幕顯示歡迎界面.點(diǎn)擊Continue啟動(dòng)CIRAS-3程序，右下角百分?jǐn)?shù)是剩余電量及使用時(shí)間，左下角溫度是儀器預(yù)熱直至達(dá)到紅外分析室工作溫度55.5 ℃.繼續(xù)等待儀器進(jìn)行自動(dòng)調(diào)零(ZERO:30 s)和差分平衡校正(Diff Bal:25 s)，此時(shí)數(shù)字參數(shù)欄為“--”狀態(tài).儀器會(huì)在0、6、12、23、39和59 min時(shí)自動(dòng)進(jìn)行調(diào)零，此后每30 min自動(dòng)調(diào)零一次.所以，使用時(shí)可以提前30 min開(kāi)機(jī)，儀器進(jìn)行預(yù)熱自檢，減少等待時(shí)間.

2.2 設(shè)定實(shí)驗(yàn)參數(shù)

CIRAS-3光合儀常用參數(shù)設(shè)置界面如圖2所示.Configuration項(xiàng)選擇形狀、大小尺寸合適的葉室.Zero DiffBal Mode(調(diào)零和差分平衡)選擇Automatic項(xiàng).如果緩沖瓶供氣，CO2Reference供氣選擇Ambient(remove chemicals)項(xiàng)，即自然環(huán)境(移除吸收劑).H2O Reference 濕度控制選擇Fixed of reference項(xiàng)，100%表示不控制濕度，但夏天濕度較大，測(cè)定時(shí)可設(shè)置為60%.Cuvette Flow(葉室氣體流速)項(xiàng)參數(shù)默認(rèn).Light Source選擇LED光源，根據(jù)測(cè)定樣品特性輸入LED值.RGBW Control項(xiàng)設(shè)置Red為90，Green為0，Blue為5，White為5.Temperature Sensor Measurement項(xiàng)選擇Energy Balance(能量平衡法).Temper Ature Control Type項(xiàng)選擇Track cuvette to ambient(使葉室溫度同環(huán)境溫度).Leaf Area(葉面積)，Boundary Layer Resistance(邊界層阻力)和Adaxial Stomata(氣孔比率)三項(xiàng)參數(shù)默認(rèn).

圖2 利用緩沖瓶供氣常用參數(shù)設(shè)置界面

2.3 判斷儀器測(cè)試狀態(tài)

CIRAS-3光合儀完成自動(dòng)調(diào)零和差分平衡后，可以利用Measured Data參數(shù)(圖3左上角)來(lái)判斷儀器測(cè)試狀態(tài)是否正常.CO2r正常范圍在380～420 μmol/mol，變化幅度為±0.1 μmol/mol且穩(wěn)定.如果CO2r低于380 μmol/mol，說(shuō)明分子篩失效需要更換.CO2r高于420 μmol/mol，說(shuō)明緩沖瓶里CO2濃度過(guò)高，需人工換氣.CO2d落差變動(dòng)幅度為±1 μmol/mol，如CO2d值高于1 μmol/mol，說(shuō)明葉室漏氣需檢修.一般要求環(huán)境相對(duì)濕度RH低于70%，如果RH高于70%，說(shuō)明濕度過(guò)高需控濕，可將參數(shù)H2O Reference值調(diào)低，或者提示溫度不正確，需檢修葉室.濕度落差H2Od值變動(dòng)幅度為±1 μmol/mol，如果H2Od高于1 μmol/mol，說(shuō)明葉室漏氣，需檢修葉室.另外，查看參數(shù)PARi值是否達(dá)到設(shè)定值且穩(wěn)定，Tamb、Tcuv、Tleaf等參數(shù)值是否正常且穩(wěn)定.

圖3 判斷儀器測(cè)試狀態(tài)程序界面

2.4 記錄有效數(shù)據(jù)

利用Photosynthesis Data參數(shù)(圖3右上角)判斷實(shí)時(shí)實(shí)地測(cè)定的光合數(shù)據(jù)是否有效.葉室打開(kāi)，夾進(jìn)葉片(葉片處于自然狀態(tài))，打開(kāi)主機(jī)，等待儀器反應(yīng)穩(wěn)定時(shí)間2～3 s，觀察A值是否上下穩(wěn)定波動(dòng)，穩(wěn)定波動(dòng)時(shí)間能否持續(xù)半分鐘.A值達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定后，再觀察參數(shù)A、Ci、Gs、E值是否出現(xiàn)極限值.一般A值在0～40之間，Ci值在0～2 000之間，Gs值在0～2 000之間，E值在0～20之間.如果A值相對(duì)穩(wěn)定，同時(shí)A、Ci、Gs、E值均無(wú)異常值后可以開(kāi)始記錄數(shù)據(jù).

3 CIRAS-3光合儀使用注意事項(xiàng)

3.1 勿過(guò)量充電

光合儀每次充電6～8 h，指示燈變綠或主機(jī)屏幕電量顯示100%即充電完成.一次充電時(shí)間不可超過(guò)12 h，過(guò)量充電會(huì)造成電池?fù)p壞，縮短電池儲(chǔ)量及使用壽命.

3.2 及時(shí)更換吸收劑

吸收劑一般均含有指示劑，吸收H2O/CO2后變質(zhì)會(huì)有顏色變化，易判斷，需要及時(shí)更換.試驗(yàn)表明，如果變質(zhì)后未更換，光合測(cè)定數(shù)據(jù)會(huì)偏低，甚至測(cè)定數(shù)據(jù)無(wú)效.

堿石灰吸附CO2后由白色變?yōu)闇\紫色，不可重復(fù)利用，如有50%失效，需更換掉失效部分.干燥劑一般是硅膠干燥劑，吸收H2O后顏色由橘黃色變?yōu)楹诤稚?，可循環(huán)利用，如有50%失效，需更換掉失效部分.分子篩為白色球形顆粒，平時(shí)可放在棕色瓶中密封保存，長(zhǎng)時(shí)間使用無(wú)明顯顏色變化.儀器連續(xù)使用一周或放置一月以上，主機(jī)開(kāi)機(jī)顯示CO2r值小于360 μmol/mol時(shí)，需要更換分子篩.

3.3 正確連接PLC葉室

PLC葉室有氣路和電信號(hào)兩路接口.電信號(hào)接口注意方向性，箭頭朝向12點(diǎn)方向凹槽處插入.電信號(hào)接口應(yīng)在斷電狀態(tài)下插拔，插拔時(shí)需握住接頭頭部用力，勿直接拉拽后端線(xiàn)纜，以免電源線(xiàn)被扯壞，當(dāng)插拔不順暢時(shí)可均勻涂抹少許凡士林潤(rùn)滑.

3.4 須晴天測(cè)定光合

研究表明，光照、濕度、溫度均會(huì)影響光合速率，野外測(cè)定光合最好在晴天，太陽(yáng)光越強(qiáng)越好.一般陰雨天氣、多云天氣和長(zhǎng)時(shí)間下雨突然放晴的天氣盡量不要測(cè)定，因?yàn)闈穸却髸r(shí)影響葉片氣孔導(dǎo)度，導(dǎo)致光合數(shù)值穩(wěn)定非常慢，效率特別低.同時(shí)，陰天時(shí)外界光強(qiáng)比較低，不能充分激活暗反應(yīng)過(guò)程中卡爾文循環(huán)中相關(guān)酶的活性，測(cè)定的光合數(shù)據(jù)往往較低.

3.5 最好上午測(cè)定光合

光合測(cè)定最好在上午，太陽(yáng)出來(lái)2 h后進(jìn)行，但測(cè)定光合作用日變化曲線(xiàn)時(shí)除外.冬天可在上午9點(diǎn)左右開(kāi)始，夏天可在上午7點(diǎn)左右開(kāi)始.中午12點(diǎn)之后不適合測(cè)定光合，因?yàn)橹形绲膹?qiáng)光和高溫常會(huì)使葉片發(fā)生光抑制，光合也會(huì)受到抑制.另外，中午的強(qiáng)光和高溫會(huì)誘導(dǎo)葉片氣孔關(guān)閉，影響光合效率.室內(nèi)樣品需人工光源光照至少2 h后測(cè)定，特定試驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)自行掌握.

3.6 需對(duì)測(cè)定材料進(jìn)行篩選

測(cè)定光合時(shí)，需選擇具有代表性且生長(zhǎng)一致的材料，如忽略材料間的差異，會(huì)導(dǎo)致光合數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差大，重復(fù)性差，數(shù)據(jù)不理想.長(zhǎng)枝條植物應(yīng)測(cè)定中部完全展開(kāi)葉.株型分散的植物應(yīng)測(cè)定相同葉位，角度、朝向一致的葉片.測(cè)定時(shí)應(yīng)測(cè)定葉片中部并避開(kāi)葉片的主脈.測(cè)定大田農(nóng)作物時(shí)，盡量避開(kāi)邊行.小麥、水稻應(yīng)測(cè)定旗葉，玉米測(cè)定穗位葉.如果測(cè)定樣品是幼苗，應(yīng)測(cè)定完全展開(kāi)葉.

3.7 提供濃度穩(wěn)定的CO2

CO2是光合作用的反應(yīng)底物，直接影響反應(yīng)速率，因此穩(wěn)定的CO2濃度是獲得穩(wěn)定光合速率的必要前提.CO2濃度波動(dòng)時(shí)，測(cè)定光合數(shù)據(jù)一定是錯(cuò)誤的.緩沖瓶是保證大田測(cè)定光合時(shí)通入穩(wěn)定的CO2濃度的重要裝置之一，可避免風(fēng)吹、人員呼吸和走動(dòng)的影響.測(cè)試時(shí)，主機(jī)和緩沖瓶要隔開(kāi)盡量遠(yuǎn)的距離，緩沖瓶需要放在主機(jī)的上風(fēng)口，勿直接放在地上，防止進(jìn)水，也可用桿支在空中，盡量減少人為因素的影響.

4 CIRAS-3光合儀日常維護(hù)和保養(yǎng)

4.1 主機(jī)

光合儀主機(jī)屬于高精度易損設(shè)備，使用時(shí)要避免磕碰，勿直接放到地面上，嚴(yán)防儀器進(jìn)水(包括緩沖瓶?jī)?nèi)進(jìn)水)和大量灰塵.存儲(chǔ)時(shí)要放置在安全干燥的地方，儀器在高溫強(qiáng)光下使用時(shí)要給主機(jī)遮陰,避免儀器過(guò)熱[9].

4.2 空氣過(guò)濾裝置

光合儀進(jìn)氣口需接上空氣過(guò)濾裝置，避免空氣中的灰塵或顆粒物大量進(jìn)入紅外線(xiàn)CO2分析儀，影響分析儀的精度，從而降低測(cè)定數(shù)據(jù)的可信度，從源頭上減少顆粒物的數(shù)量.空氣過(guò)濾裝置種類(lèi)多且構(gòu)造簡(jiǎn)單，只要能達(dá)到過(guò)濾灰塵或顆粒物的效果即可.

4.3 吸收劑

硅膠干燥劑變?yōu)楹诤稚笾糜诤嫦渲?80 ℃以下)烘至顏色恢復(fù)橘黃色即可，可重復(fù)利用.堿石灰吸收CO2后發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，無(wú)法恢復(fù)，不能重復(fù)使用.分子篩也不能重復(fù)利用，需及時(shí)更換.

4.4 葉室

儀器不用時(shí)葉室應(yīng)打開(kāi)存放，可避免葉室上下黑色方形橡膠圈因長(zhǎng)時(shí)間擠壓變形，導(dǎo)致葉室因密封不嚴(yán)而漏氣.如果葉室密封不嚴(yán)，會(huì)導(dǎo)致測(cè)定數(shù)據(jù)極不穩(wěn)定，重復(fù)性差，可信度嚴(yán)重降低.另外，長(zhǎng)時(shí)間使用或放置都會(huì)導(dǎo)致葉室密封材料老化，建議葉室密封材料每年更換一次.定期檢查葉室上的螺絲是否松動(dòng)，若有松動(dòng)，及時(shí)擰緊.

4.5 電池

光合儀長(zhǎng)期虧電會(huì)導(dǎo)致鋰電池儲(chǔ)電功能大幅降低，影響電池使用壽命.建議儀器使用結(jié)束，要充滿(mǎn)電后存放，尤其是冬季不經(jīng)常使用時(shí)，需定期(45天左右)給電池充電并運(yùn)行儀器4 h左右以排出濕氣.

5 常見(jiàn)問(wèn)題解決方法

5.1 光量子探頭出現(xiàn)松動(dòng)

葉室上PARe外置光量子探頭如果松動(dòng)，切記不要旋轉(zhuǎn)，以免將內(nèi)部連線(xiàn)擰斷，應(yīng)該用“502”或“401”等強(qiáng)力膠固定.

5.2 儀器開(kāi)機(jī)后噪聲大

儀器氣路堵塞或者漏氣會(huì)造成儀器開(kāi)機(jī)后噪聲大，此種情況下可以檢查緩沖管是否受到擠壓，檢查后面吸收管接口是否全部插入儀器，檢查吸收管黑色頭的兩側(cè)黑色密封圈是否脫槽.

5.3 CO2r值不穩(wěn)定

如果CO2r值持續(xù)下降，可能是CO2沒(méi)有達(dá)到平衡，如把緩沖瓶剛從室內(nèi)(CO2濃度較高)拿到室外(CO2濃度較低)，可等到CO2自動(dòng)平衡，或?qū)⒕彌_瓶蓋子打開(kāi)在空氣中來(lái)回?cái)[動(dòng)加快平衡.如果CO2r值不斷波動(dòng)，在主機(jī)周?chē)禋?，CO2r值會(huì)明顯增加，說(shuō)明主機(jī)內(nèi)有氣路管道斷開(kāi)造成漏氣，可以打開(kāi)前面板檢查.

5.4 Tleaf值明顯不正常

正常情況下，不控溫時(shí)Tamb、Tcuv和Tleaf值相近，如果Tleaf值明顯異常，可能是葉室紅外輻射探頭污染，此時(shí)可以對(duì)settings中“Temperature sensor measurement”項(xiàng)進(jìn)行設(shè)定，將“IR sensor”改為“Energy balance”.

5.5 Gs出現(xiàn)9999或者Ci出現(xiàn)0

正常情況下，Gs在0～2 000之間，Ci值在0～CO2r之間.Ci值出現(xiàn)0，可能會(huì)伴隨RH值高于70%的現(xiàn)象.首先檢查H2Or值，如果H2Or高于20 kPa，則需要控濕，在Control項(xiàng)下調(diào)H2O Reference比例.如果H2Or低于20 kPa，則檢查T(mén)leaf或Tcuv是否與Tamb相近，如果異常說(shuō)明溫度檢測(cè)異常，則需要聯(lián)系維修.

6 結(jié)語(yǔ)

CIRAS-3光合儀作為便攜式儀器常在野外使用，如果操作不當(dāng)或使用錯(cuò)誤，不但降低測(cè)試效率，也影響實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)度.保證儀器處于良好的運(yùn)行狀態(tài)，正確操作使用儀器，準(zhǔn)確判斷儀器測(cè)試狀態(tài)，選擇適宜的測(cè)試環(huán)境、時(shí)間和樣品，注意日常維護(hù)和保養(yǎng)，延長(zhǎng)儀器使用壽命，提高使用者的測(cè)試水平，可切實(shí)提高CIRAS-3光合儀的使用效率.