李宏偉，孔德欽，于衛(wèi)華，吳昊，王釗，劉瑞，海春旭，王欣，劉江正，，李文麗，

(1.空軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系軍事毒理學(xué)與防化醫(yī)學(xué)教研室，陜西省自由基生物學(xué)與醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，教育部特殊作業(yè)環(huán)境危害評(píng)估與防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安710032；2.63710部隊(duì)醫(yī)院，山西忻州036301)

伴隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，酒精類飲品的消費(fèi)量呈現(xiàn)逐年提高的趨勢(shì)，部分人群有酗酒習(xí)慣，已經(jīng)成為嚴(yán)重危害身心健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題。長(zhǎng)期或者大量攝入酒精可以導(dǎo)致胃壁的急性或慢性損傷，臨床較為常見的是急慢性胃炎或者潰瘍。酒精作為一種有機(jī)溶劑，極易通過(guò)生物膜，胃壁是重要的吸收途徑之一，胃壁上皮細(xì)胞接觸的酒精濃度往往較高，反復(fù)高劑量暴露容易導(dǎo)致胃壁損傷。針對(duì)酒精誘導(dǎo)胃壁損傷目前還缺乏有效的防治藥物，從中醫(yī)藥中尋找安全有效的化學(xué)單體是解決這一難題的新思路與新途徑。

酒精誘導(dǎo)胃壁損傷的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，可能與胃壁保護(hù)性和侵襲性因素之間的平衡紊亂有關(guān)，胃壁屏障功能降低、血管結(jié)構(gòu)和功能紊亂、氧化應(yīng)激損傷、過(guò)度炎癥反應(yīng)、胃酸分泌等可能參與了酒精性胃壁損傷的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。其中，酒精在代謝過(guò)程中通過(guò)細(xì)胞色素P450家族成員2E1(CYP2E1)等途徑可以產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)和自由基，氧化應(yīng)激損傷被認(rèn)為是核心機(jī)制之一。酒精暴露還能激活胃壁組織內(nèi)炎癥細(xì)胞和免疫細(xì)胞等，激活炎癥通路，導(dǎo)致炎癥損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)炎癥性損傷，進(jìn)而損傷胃壁。針對(duì)酒精誘導(dǎo)胃壁損傷的氧化應(yīng)激與炎癥機(jī)制，采用合理的抗氧化和抗炎藥物干預(yù)可能對(duì)于減輕酒精誘導(dǎo)胃壁損傷具有良好保護(hù)作用。

齊墩果酸(oleanolic acid，OA)是一種廣泛分布于植物體內(nèi)的五環(huán)三萜類天然化合物(圖1)，是多種中藥有效成分之一，同時(shí)也是人類飲食中不可缺少的組成部分。OA常溫下為白色結(jié)晶性粉末，密度是1.1 g/cm，幾乎不溶于水，可溶于酒精。OA已被證明具有較好的抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用。但OA對(duì)酒精誘導(dǎo)胃壁損傷是否具有保護(hù)作用還未見報(bào)道。本研究旨在探討OA對(duì)酒精誘導(dǎo)胃壁損傷的保護(hù)作用，并明確抗氧化和抗炎是否參與了上述保護(hù)作用，為臨床上酒精性胃壁損傷的防治提供新的途徑和思路。

圖1 齊墩果酸(C30H48O3)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性清潔級(jí)SD大鼠24只，體質(zhì)量(180±20)g，購(gòu)于空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)于本教研室SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，自由攝入水和普通飼料，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。動(dòng)物房?jī)?nèi)環(huán)境相對(duì)濕度(50±10)%，溫度(25±2)℃，12 h/12 h交替晝夜循環(huán)，每日觀察動(dòng)物一般情況。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

齊墩果酸(CAS號(hào)508-02-1)購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，乙醇(CAS號(hào)64-17-5)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量檢測(cè)試劑盒、氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione，GSSG)和還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量檢測(cè)試劑盒、蛋白提取試劑盒均購(gòu)于南京建成生物技術(shù)研究所。RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green一步法RTPCR試劑盒購(gòu)于中國(guó)TIANGEN公司。BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo Scientific公司。NF-E2相關(guān)因子(nuclear erythroid 2-related factor 2，Nrf-2)抗體、TNF-a抗體、IL-6抗體均購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。β-actin一抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。所有其他化學(xué)品均為化學(xué)純以上級(jí)別。

1.2.2 主要儀器

TE2000倒置顯微鏡系統(tǒng)購(gòu)于日本Nikon公司；SCIENTZ-48高通量組織研磨器購(gòu)于新芝公司；全自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；Infinite M200 Pro全波段酶標(biāo)儀購(gòu)于瑞士Tecan公司；Mini-PROTEAN電泳系統(tǒng)、蛋白半干轉(zhuǎn)裝置及凝膠成像與分析系統(tǒng)均為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組和處理

隨機(jī)數(shù)表法將24只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、酒精暴露組、OA干預(yù)組共3組，每組8只。對(duì)照組，每天灌胃同等熱量葡萄糖溶液，持續(xù)30 d；酒精暴露組，采取灌胃方式給予酒精(4 g/kg，50%，

V/V

)，持續(xù)30 d；OA干預(yù)組，采取灌胃方式給予溶解了10 mg/kg OA的酒精(4 g/kg，50%，

V/V

)溶液中，持續(xù)30 d。

末次處理6 h后，使用5%苯巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，然后取出胃，使用眼科剪小心剪開胃壁，展開后數(shù)碼相機(jī)拍照。取部分胃中部組織于4%多聚甲醛溶液中，HE染色觀察。其余胃組織用冰冷的生理鹽水沖洗血水，取一部分胃組織在預(yù)冷生理鹽水中制備5%的胃組織勻漿液，所有步驟均在冰浴條件下進(jìn)行。剩余胃組織于-80℃條件下保存。

1.3.2 組織病理學(xué)檢測(cè)

胃組織用4%多聚甲醛固定。將組織塊包埋于石蠟中，并切成5 μm厚。蘇木精-伊紅(HE)染色后，使用倒置顯微鏡觀察組織病理學(xué)改變。

1.3.3 氧化損傷及抗氧化指標(biāo)檢測(cè)

用眼科剪將100 mg胃壁組織剪碎，置于4 mL EP管中，加入1.9 mL預(yù)冷的生理鹽水，SCIENTZ-48高通量組織研磨器振蕩勻漿(30 Hz頻率，運(yùn)行10 s，停止20 s，重復(fù)5次)，制備成5%胃組織勻漿，以測(cè)定胃組織氧化損傷指標(biāo)。嚴(yán)格按照MDA、GSSG和GSH含量檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書操作步驟完成。

1.3.4 RT-PCR檢測(cè)

使用Trizol試劑(TaKaRa)從大鼠胃壁組織中提取總RNA。收集RNA溶解在無(wú)DNase/RNase的水中。使用NanoDrop 2000分光光度計(jì)(Thermo，美國(guó))分析RNA的濃度和純度。使用EasyScript First-Strand cDNA合成超級(jí)混合試劑盒(Thermo Fisher SCIENTIFIC)對(duì)提取的總RNA(1 μg)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件如下：42℃、60 min，70℃、5 min。使 用QuantStudio 7 Flex實(shí) 時(shí)PCR系 統(tǒng)(Thermo Fisher SCIENTIFIC，美國(guó))和SYBR premix Ex Taq試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行基因擴(kuò)增，循環(huán)條件為95℃、15 s，60℃、20 s，72℃、20 s。cDNA引物(5′-3′)為：TNF-a(F：GCGTGTTCATCCGTTCTCTACC；R：TACTTCAGCGTCTCGTGTGTTTCT)。IL-6(F：CCC ACCAGGAACGAAAGTCA，R：GCGGAGAGAAACTT CATAGCTGTT。Nrf-2(F：GCTGATACTACCGCTGTTC；R：GTGGAGAGGATGCTGCTGA)。mRNA的相對(duì)定量值使用2方法，

β-actin

基因作為內(nèi)參基因。

1.3.5 Western blot檢測(cè)

通過(guò)組織蛋白提取試劑盒提取胃壁組織總蛋白質(zhì)。使用BCA蛋白定量試劑盒定量樣品蛋白，取30 μg蛋白在12.5% SDS-PAGE上分離(恒壓120 V，電泳時(shí)間約1.5 h)，半干轉(zhuǎn)到PVDF膜上(甲醇浸泡)，并在37℃下在5%脫脂奶粉中封閉2 h。TNF-a、IL-6、Nrf-2、Tubulin(1∶1 000)一抗4℃下孵育過(guò)夜，然后TBST清洗4次。二抗(1∶5 000)37℃下孵育1 h，使用Bio-Rad Quantity One軟件對(duì)條帶進(jìn)行定量分析，采用Tubulin作為內(nèi)參蛋白。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用

x

ˉ±

s

表示，運(yùn)用Graphpad Prism分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用LSD

t

檢驗(yàn)進(jìn)行組間的兩兩比較，以

α

=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 OA干預(yù)對(duì)酒精誘導(dǎo)胃組織病理學(xué)損傷的影響

采用HE染色檢查胃組織病理學(xué)變化，結(jié)果見圖2。對(duì)照組表現(xiàn)為正常的胃壁顏色和結(jié)構(gòu)。與對(duì)照組相比，酒精暴露組的胃壁顏色較深，HE染色可見胃壁表面黏液層受損，部分胃小凹消失，黏膜下層可見大量紅細(xì)胞。OA干預(yù)組顯著減輕了酒精導(dǎo)致的胃壁損傷性改變。以上結(jié)果表明，酒精暴露能夠誘導(dǎo)大鼠胃壁組織結(jié)構(gòu)發(fā)生損傷，OA干預(yù)具有保護(hù)作用。

圖2 OA干預(yù)對(duì)酒精誘導(dǎo)胃壁組織病理學(xué)損傷的影響

2.2 OA干預(yù)對(duì)酒精誘導(dǎo)大鼠胃壁組織氧化應(yīng)激損傷的影響

MDA和GSSG檢測(cè)結(jié)果見圖3，可見與對(duì)照組比較，酒精暴露能夠?qū)е挛副诮M織MDA和GSSG水平顯著上升(

P

<0.05)，而與酒精暴露組相比，OA干預(yù)能夠顯著抑制酒精誘導(dǎo)的MDA和GSSG水平升高(

P<

0.05

)

。以上結(jié)果表明OA干預(yù)能夠顯著地減輕酒精誘導(dǎo)的胃壁組織氧化應(yīng)激損傷。

圖3 OA干預(yù)對(duì)酒精誘導(dǎo)大鼠胃壁組織氧化應(yīng)激損傷的影響

2.3 OA干預(yù)對(duì)酒精暴露后大鼠胃壁組織抗氧化功能影響

結(jié)果如圖4所示。與對(duì)照組相比，酒精暴露組大鼠胃壁組織GSH水平和GSH/GSSG比值顯著降低(

P

<0.05)，而與酒精暴露組比較，OA干預(yù)明顯抑制了酒精誘導(dǎo)的GSH水平和GSH/GSSG比值的降低(

P

<0.05)。為了進(jìn)一步研究抗氧化酶的調(diào)控機(jī)制，我們檢測(cè)了Nrf-2的mRNA和蛋白表達(dá)狀況。RT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組相比，酒精暴露導(dǎo)致Nrf-2的mRNA和蛋白表達(dá)均升高(

P

<0.05)。與酒精暴露組相比，OA干預(yù)進(jìn)一步增加了Nrf-2的mRNA和蛋白表達(dá)(

P

<0.05)。以上結(jié)果提示，以Nrf-2為核心的抗氧化防御體系功能增強(qiáng)可能參與了OA處理對(duì)酒精誘導(dǎo)胃壁損傷的保護(hù)作用。

圖4 OA干預(yù)處理對(duì)酒精暴露后大鼠胃壁組織抗氧化功能的影響

2.4 OA干預(yù)對(duì)酒精誘導(dǎo)大鼠胃壁組織炎癥反應(yīng)的影響

結(jié)果見圖5。和正常對(duì)照組相比，酒精暴露導(dǎo)致大鼠胃壁組織TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白水平均顯著升高(

P

<0.05)。而OA干預(yù)后，上述基因和蛋白表達(dá)受到顯著抑制。這些結(jié)果表明OA可以通過(guò)抗炎通路抑制酒精誘導(dǎo)的胃壁損傷。

圖5 OA共處理對(duì)酒精誘導(dǎo)大鼠胃組織炎癥反應(yīng)的影響(n=3)

3 討論

本文通過(guò)給予大鼠經(jīng)口灌胃高濃度酒精(4 g/kg，50%，

V/V

)方式成功建立酒精性胃壁損傷模型，研究了OA干預(yù)后對(duì)大鼠胃壁損傷的改善作用。結(jié)果顯示，OA降低大鼠胃壁表面黏液層受損狀況，黏膜下層紅細(xì)胞明顯減少，降低炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)過(guò)氧化水平，具有顯著的抗酒精性氧化應(yīng)激損傷和抗炎作用。

氧化應(yīng)激是酒精性胃壁損傷的關(guān)鍵機(jī)制之一。過(guò)量酒精在體內(nèi)不能及時(shí)代謝，會(huì)誘導(dǎo)大量超氧化物、羥基陰離子和過(guò)氧化氫等活性氧的產(chǎn)生，引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，損害細(xì)胞結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步造成機(jī)體功能障礙。MDA、GSH和氧化型谷胱甘肽(GSSG)在胃壁組織中的濃度以及MDA的血漿濃度被用作氧化應(yīng)激的生化標(biāo)志物。MDA是細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物之一，引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，具有細(xì)胞毒性。當(dāng)DNA的雙螺旋被交聯(lián)而不能打開，致使細(xì)胞死亡，同樣蛋白質(zhì)被交聯(lián)后形成沉淀物，蛋白質(zhì)被破壞，細(xì)胞功能受到影響。機(jī)體正常狀態(tài)時(shí)，ROS處于低水平，當(dāng)ROS產(chǎn)生過(guò)量時(shí)可以使GSH轉(zhuǎn)變?yōu)镚SSG，發(fā)揮抑制ROS清除的作用。文獻(xiàn)[8]報(bào)道Nrf-2是機(jī)體調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，可以從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，正向調(diào)節(jié)II相解毒酶和抗氧化酶等靶基因的表達(dá)，從而有效改善氧化反應(yīng)。在本研究中，OA干預(yù)能夠顯著降低MDA和GSSG水平，增加Nrf-2的表達(dá)水平，提示OA可以通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激作用來(lái)改善胃損傷。

眾多研究表明，TNF-α、IL-6等多種炎癥因子對(duì)急性胃潰瘍發(fā)揮關(guān)鍵作用，TNF-α能引導(dǎo)中性粒細(xì)胞向胃壁組織浸潤(rùn)，IL-6通過(guò)STAT途徑介導(dǎo)激活NF-κB信號(hào)通路，導(dǎo)致上皮細(xì)胞黏附分子、中性粒細(xì)胞的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明OA降低大鼠TNF-α、IL-6的表達(dá)水平，進(jìn)而改善胃壁損傷。

綜上所述，本研究表明OA對(duì)酒精誘導(dǎo)的大鼠胃壁損傷具有顯著的保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制可能與OA的抗氧化活性和抗炎作用有關(guān)。本研究提示OA可能是一種臨床上緩解酒精中毒導(dǎo)致胃損傷的有效藥物。OA治療酒精誘導(dǎo)胃壁氧化損傷和炎癥反應(yīng)的機(jī)制研究尚處于初級(jí)認(rèn)識(shí)階段，以轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等高、新、尖的科研技術(shù)為研究手段，探索其作用機(jī)制任重道遠(yuǎn)。