陸雪梅，許銘炎，劉庭英，張秋芳，鄧小玲

(1.廈門醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，廈門市口腔疾病診療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門361003；2.廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，福建廈門361102；3.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院唇腭裂中心，廣東汕頭515041)

非綜合征型唇腭裂(nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate，NSCL/P)是指不伴有其他先天畸形的唇腭裂。根據(jù)臨床表現(xiàn)，可以分為單純性唇裂(cleft lip only，CLO)、單純性腭裂(cleft palate only，CPO)以及唇裂伴腭裂(cleft lip with palate，CLP)。NSCL/P是全世界最常見的先天畸形之一，發(fā)病率在不同民族和地理區(qū)域之間存在較大差異，在中國(guó)，NSCL/P的發(fā)病率約為1.42‰。

NSCL/P是一種受遺傳和環(huán)境因素交互作用的遺傳性疾病，其潛在的遺傳因素及分子機(jī)制尚不清楚，研究發(fā)現(xiàn)許多基因參與了NSCL/P的發(fā)生，如干擾素調(diào)節(jié)因子6(interferon regulatory factor 6，IRF6)、肌肉片段同源盒1(muscle segment homeobox 1，MSX1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor β，TGF-β)、5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylenetetrahydro?folate reductase，MTHFR)和叉頭框E1(forkhead box El，F(xiàn)OXE1)等，其中MTHFR基因被認(rèn)為是NSCL/P的一個(gè)易感候選基因，引起廣泛關(guān)注。MTHFR基因定位于染色體1p36.3，編碼亞甲基四氫葉酸還原酶，在生物體葉酸代謝過程中起重要作用。而葉酸參與細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)及核酸、氨基酸、蛋白質(zhì)的合成等過程，有研究顯示葉酸缺乏或代謝障礙會(huì)使DNA不能正常甲基化，導(dǎo)致多種神經(jīng)管缺陷，因此MTHFR基因多態(tài)性被認(rèn)為與多種出生缺陷疾病有關(guān)，受孕早期補(bǔ)充葉酸可降低后代唇腭裂發(fā)病率，服用葉酸預(yù)防NSCL/P也被廣大父母所認(rèn)同。

MTHFR基因與NSCL/P的發(fā)病是否相關(guān)尚未得到一致結(jié)論。據(jù)報(bào)道在MTHFR基因上有多個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位點(diǎn)與NSCL/P有 關(guān)，其 中rs1801131位 點(diǎn)(A1298C)和rs1801133位點(diǎn)(C677T)較為常見，但在不同地理區(qū)域和不同民族中存在差異。多篇研究發(fā)現(xiàn)MTHFR基因rs1801133多態(tài)性與NSCL/P相關(guān)，該基因突變能夠增加中國(guó)漢族人群罹患NSCL/P的風(fēng)險(xiǎn)。而MTHFR基因rs1801131多態(tài)性與NSCL/P的關(guān)系報(bào)道相對(duì)較少，尚無一致的結(jié)論。MTHFR基因rs1801131位點(diǎn)多態(tài)性是指1298A→C(腺嘌呤→胞嘧啶)基因突變，使編碼后的谷氨酸被丙氨酸替代，導(dǎo)致MTHFR酶活性和熱穩(wěn)定性降低，影響細(xì)胞內(nèi)葉酸正常代謝、DNA合成反應(yīng)及甲基化，破壞基因組的穩(wěn)定性及完整性，進(jìn)而增加了NSCL/P的易感性。本研究采取病例對(duì)照、傳遞不平衡及家系分析等方法對(duì)中國(guó)潮汕地區(qū)漢族人群MTHFR基因rs1801131位點(diǎn)多態(tài)性與NSCL/P易感性的相關(guān)性進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2008—2011年間潮汕地區(qū)漢族非綜合征NSCL/P患者357例、患兒父親199例和患兒母親198例及其來自同地區(qū)健康志愿者354名為正常對(duì)照組，均已排除三代以內(nèi)家族性唇腭裂遺傳史，基本資料見表1。此研究所有參與者均已簽署知情同意書，并通過汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 病例組與對(duì)照組的基本資料

1.2 DNA提取及基因分型

采集研究者外周血5 mL，EDTA抗凝后使用DP318-血液基因組提取試劑盒(北京天根生化科技公司)，按照試劑盒說明書操作提取外周血白細(xì)胞基因組DNA；采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)技術(shù)進(jìn)行基因分型。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用χ檢驗(yàn)對(duì)資料進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)，比較各組基因型及等位基因頻率的差異(檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)為α=0.05)，并計(jì)算OR值及其95%可信區(qū)間。對(duì)雙親中至少一方含有雜合子的核心家庭進(jìn)行等位基因傳遞不平衡檢驗(yàn)(transmission disequilibrium test，TDT)。對(duì) 所 有 的 基因多態(tài)性遺傳資料應(yīng)用FBAT 2.0.2軟件(www.biostat.harvard.edu/fbat/default.html)進(jìn)行家系分析。

2 結(jié)果

2.1 基因型分布的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

病例組和對(duì)照組人群的平衡檢測(cè)結(jié)果如表2所示，均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，可確認(rèn)樣本具有群體代表性。

表2 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

2.2 基因型及等位基因在病例組、雙親組和對(duì)照組的分布和比較

利用MALDI-TOF-MS技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了

MTHFR

基因rs1801131位點(diǎn)多態(tài)性的高通量分型，其基因型與等位基因在病例組、雙親組和對(duì)照組的分布頻率如表3所示?？ǚ綑z驗(yàn)的結(jié)果顯示所有病例組、單純唇裂組、單純腭裂組和唇裂伴有腭裂組的基因型及等位基因分布與對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P>

0.05)。評(píng)估每種基因型相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度的比值比(OR值)發(fā)現(xiàn)各組人群中CC和AC基因型攜帶者相對(duì)于AA基因型攜帶者的OR值的95%可信區(qū)間(CI)均包含1，這說明攜帶一個(gè)或者兩個(gè)突變等位基因，并不能顯著提高或者降低唇腭裂的患病風(fēng)險(xiǎn)。以上病例-對(duì)照研究的結(jié)果提示

MTHFR

基因rs1801131位點(diǎn)基因型多態(tài)性和等位基因多態(tài)性與NSCL/P的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)不存在相關(guān)性。

表3 基因型及等位基因分布

2.3 TDT檢驗(yàn)

對(duì)含有雜合子信息雙親的核心家庭(135例)進(jìn)行TDT分析，結(jié)果如表4所示，在

MTHFR

rs1801131位點(diǎn)父母?jìng)鬟f給患病子女的等位基因A和C分別為62個(gè)和73個(gè)，卡方檢驗(yàn)顯示該位點(diǎn)等位基因與NSCL/P患者之間未發(fā)現(xiàn)有連鎖不平衡存在(

P

>0.05)。

表4 MTHFR rs1801131位點(diǎn)等位基因傳遞不平衡檢驗(yàn)

2.4 家系分析

為了進(jìn)一步利用

MTHFR

rs1801131位點(diǎn)雜合子和純合子的遺傳信息，運(yùn)用家系關(guān)聯(lián)性分析軟件對(duì)109個(gè)核心家庭遺傳信息進(jìn)行分析，結(jié)果見表5，發(fā)現(xiàn)

MTHFR

rs1801131位點(diǎn)的等位基因A或C在病例組和單純唇裂組、單純腭裂組和唇裂伴有腭裂組的分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)。

表5 MTHFR rs1801131位點(diǎn)家系分析

3 討論

潮汕地區(qū)位于廣東省東南沿海，由于歷史和地理的原因，形成了一個(gè)具有特殊風(fēng)俗習(xí)慣和方言的漢族群體，擁有與中國(guó)其他地區(qū)的漢族群體不同的分子遺傳信息。本研究利用高通量基因分型技術(shù)，對(duì)潮汕地區(qū)漢族人群的

MTHFR

rs1801131位點(diǎn)的基因多態(tài)性進(jìn)行分型，并對(duì)NSCL/P發(fā)病的遺傳相關(guān)性進(jìn)行研究。NSCL/P的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，普遍認(rèn)為NSCL/P是遺傳基因和環(huán)境相互作用的具有遺傳易感性的疾病，基因的多態(tài)性變異是主要致病因素之一，篩選NSCL/P的易感基因有助于為NSCL/P的檢測(cè)和預(yù)防提供科學(xué)依據(jù)。

本研究首先對(duì)病例組和對(duì)照組人群基因型分布進(jìn)行Hardy-Weinberg檢驗(yàn)，結(jié)果人群并未偏離Hardy-Weinberg定律(P>0.05)，提示本研究所收集的樣本信息具有一定的代表性，能夠代表潮汕地區(qū)漢族人群。利用病例-對(duì)照研究，在等位基因頻率分布中我們發(fā)現(xiàn)病例組和病例父母組與對(duì)照組中rs1801131位點(diǎn)等位基因和基因型的分布相似，且等位基因C的頻率均在20%左右；TDT檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)rs1801131位點(diǎn)A等位基因在唇腭裂患者中不存在傳遞(P>0.05)；進(jìn)一步利用家庭為基礎(chǔ)的相關(guān)性分析，證實(shí)了rs1801131位點(diǎn)的A等位基因或C等位基因的分布頻率與唇腭裂的發(fā)病并無顯著相關(guān)關(guān)系。所有這些研究表明潮汕地區(qū)漢族人群MTHFR基因rs1801131位點(diǎn)的多態(tài)性與NSCL/P不存在相關(guān)性，該結(jié)論與李三華等報(bào)道一致，而與Han等研究結(jié)果不一致，這可能與研究人群、基因分型方法和樣本量等影響因素相關(guān)。

傳統(tǒng)的唇腭裂相關(guān)候選基因關(guān)聯(lián)性分析是通過病例-對(duì)照研究設(shè)計(jì)，這種研究設(shè)計(jì)不能避免人口混雜造成的統(tǒng)計(jì)偏倚。而這種混雜偏倚不同于多種環(huán)境因素引起的偏倚，即使采用分層分析或多因素回歸分析也不能有效控制這類偏倚，最終可能導(dǎo)致基因與疾病虛假的關(guān)聯(lián)信息。利用TDT檢驗(yàn)和以家庭為基礎(chǔ)的相關(guān)性分析可避免上述人口混雜造成偏倚，本研究通過TDT檢驗(yàn)和FBAT檢驗(yàn)不僅充分利用核心家庭和家系資料進(jìn)行遺傳分析，而且從不同角度進(jìn)一步驗(yàn)證MTHFR基因rs1801131位點(diǎn)的多態(tài)性與NSCL/P病例-對(duì)照相關(guān)性研究的結(jié)果，使得結(jié)論更有說服力，是值得推廣和應(yīng)用的家系統(tǒng)計(jì)分析方法。

PCR是常用檢測(cè)SNP位點(diǎn)的方法，具有技術(shù)簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，能夠?qū)σ阎猄NP位點(diǎn)進(jìn)行區(qū)分，但只適用于少量樣本的檢測(cè)，檢測(cè)大樣本量的SNP位點(diǎn)時(shí)有一定的限制，而MALDI-TOF-MS技術(shù)利用質(zhì)譜分析對(duì)分子量的靈敏度特別高，通過區(qū)分單堿基不同的兩段基因序列，對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型，能實(shí)現(xiàn)多個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行大規(guī)模的人群篩查。本研究正是利用該技術(shù)對(duì)MTHFR基因rs1801131位點(diǎn)進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地基因分型。

總之，本研究利用病例-對(duì)照、TDT和家系分析等多種遺傳分析的方法發(fā)現(xiàn)潮汕地區(qū)漢族人群MTHFR基因rs1801131多態(tài)性與NSCL/P患病風(fēng)險(xiǎn)無顯著相關(guān)性，提示MTHFR基因rs1801131多態(tài)性可能不參與中國(guó)潮汕地區(qū)漢族人群唇腭裂的發(fā)生。