李柏茹，秦雙建，關(guān)嵐，李閏冰，蔡穎，蒲桔寧，曾明，肖芳，徐新云

(1.深圳市疾病預(yù)防控制中心，廣東深圳518055；2.中南大學(xué)湘雅公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410078；3.南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南衡陽(yáng)421001)

隨著經(jīng)濟(jì)迅速發(fā)展，環(huán)境污染問(wèn)題日益突出。在大氣污染物中占主要成分的大氣細(xì)顆粒物(fine particulate matter，PM)是指空氣動(dòng)力學(xué)當(dāng)量直徑≤2.5 μm的顆粒物，因其比表面積大故可以吸附大量的有毒有害物質(zhì)，例如重金屬和有機(jī)物等。PM可以通過(guò)呼吸作用進(jìn)入深部呼吸道，利用血液運(yùn)輸?shù)竭_(dá)身體的各個(gè)部位，甚至可能對(duì)心血管系統(tǒng)和腎臟造成損害。2013年“全球疾病負(fù)擔(dān)研究”顯示，暴露于環(huán)境可吸入顆粒物在全球殘疾調(diào)整壽命年風(fēng)險(xiǎn)因素中排名第12位。PM可以通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷。一項(xiàng)關(guān)于PM短期暴露的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，PM可加重小鼠的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)從而導(dǎo)致小鼠腎臟損傷。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)PM可能通過(guò)p38MAPK和ERK1/2信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷。短暫的PM暴露與內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加、T淋巴細(xì)胞水平升高等有關(guān)，并且這些變化可能導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化和急性冠狀動(dòng)脈后遺癥。研究發(fā)現(xiàn)PM暴露不但可誘導(dǎo)活性氧生成還可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-486可以靶向負(fù)調(diào)控PTEN和FOXO1的蛋白水平以減輕PM誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。還有研究指出PM可以激活血管內(nèi)皮細(xì)胞中COX-2/PGES/PGE2的炎癥軸，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。盡管當(dāng)前已經(jīng)進(jìn)行了很多關(guān)于PM和細(xì)胞氧化損傷及凋亡的研究，但是鮮有關(guān)于PM導(dǎo)致人類(lèi)正常腎細(xì)胞氧化損傷及凋亡的研究報(bào)道，因此本文以人腎上皮HK-2細(xì)胞為研究對(duì)象，探討PM處理后對(duì)腎細(xì)胞氧化損傷和凋亡的影響及分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Annexin V-APC/7-AAD凋亡試劑盒(APl05)購(gòu)于聯(lián)科生物公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒、微量還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)試劑盒和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所；HK-2細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)上海細(xì)胞庫(kù)，0.25% Trpsin-EDTA、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。

1.2 PM2.5樣品采集與制備

用武漢天虹TH150F中流量采樣器和80 mm直徑的石英濾膜，按100 L/min的流量連續(xù)采樣3 d，每天24 h不間斷，采樣地點(diǎn)在太原山西大學(xué)校園和深圳市疾病預(yù)防控制中心樓頂。對(duì)吸附有PM的濾膜稱(chēng)質(zhì)量后剪成2 cm×2 cm小塊放于燒杯中，加入超純水完全浸沒(méi)濾膜，用一層錫箔紙使燒杯口密封，超聲振蕩30 min后取出濾膜，將PM樣品懸濁液轉(zhuǎn)移到干凈的真空冷凍物料盤(pán)中，再次用錫箔紙密封后于-80℃冰箱冷凍24 h；用封口膜替換錫箔紙，并在膜上點(diǎn)密集的小孔，于真空冷凍干燥機(jī)中干燥24 h至PM完全干燥；然后在無(wú)菌工作臺(tái)中用超純水溶解干燥的PM顆粒，混合均勻，將PM混懸液分裝標(biāo)記后于-20℃保存待用，每次使用前振蕩混勻。

1.3 HK-2細(xì)胞培養(yǎng)與PM2.5處理分組

使用DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)于37℃、CO體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定且匯合度達(dá)80%時(shí)使用DMEM稀釋的PM培養(yǎng)液進(jìn)行處理，根據(jù)前期CCK-8試驗(yàn)得到深圳市和太原市PM處理HK-2細(xì)胞的IC分別為136和95.98 μg/mL，Cr處理HK-2細(xì)胞的IC為16.75 μmol/L，因此本文設(shè)置PM濃度為50 μg/mL，陽(yáng)性對(duì)照組Cr濃度為10 μmol/L，在培養(yǎng)箱中處理24 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行各指標(biāo)檢測(cè)。

1.4 檢測(cè)細(xì)胞氧化損傷

PM處理細(xì)胞24 h后，吸出培養(yǎng)液，用冷PBS洗3次，加入免疫沉淀(immunol precipitation，IP)細(xì)胞裂解 液(碧 云 天，P0013)400 μL對(duì)25 cm培 養(yǎng) 瓶(Corning，430639)中細(xì)胞裂解30 min，用細(xì)胞刮將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶刮下，細(xì)胞混合物移入1.5 mL EP管中并在冰上超聲破碎5 s，間斷3 s，重復(fù)5次，于14 000 r/min在4℃離心20 min，取上清液于-80℃冰箱保存；用二辛可寧酸法(BCA法)進(jìn)行樣品蛋白定量；嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行MDA含量、SOD活性、GSH含量和GSH-PX活性的檢測(cè)和計(jì)算。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

收集PM處理24 h的細(xì)胞于1.5 mL EP管中，加入l mL預(yù)冷的PBS，離心3 min后棄去上清(重復(fù)兩次)；將試劑盒中的5×結(jié)合緩沖液用去離子水稀釋為工作液(1×)，取適量預(yù)冷的工作液加入到EP管中并吹打重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10~1×10個(gè)/mL。每組取100 μL細(xì)胞懸液到1.5 mL EP管中，分別加入5 μL Annexin V-APC和10 μL 7-AAD，輕微混勻后室溫避光孵育15 min；無(wú)需洗滌，每管再加380 μL預(yù)冷的工作液并充分吹打混勻；上流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；應(yīng)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用方差分析進(jìn)行組間比較，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞氧化損傷檢測(cè)結(jié)果

PM處理HK-2細(xì)胞24 h后，結(jié)果顯示：與陰性對(duì)照組相比，深圳PM樣品組、太原PM樣品組和陽(yáng)性對(duì)照組中MDA的濃度依次升高，分別升高8.16%、34.51%和72.23%(圖1A)；SOD活性依次降低，分別降低7.49%、19.67%和29.55%(圖1B)；GSH的濃度依次降低，分別降低10.43%、16.39%和37.43%(圖1C)。太原PM樣品組與陰性對(duì)照組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05或

P

<0.01)；GSH-PX的活性分別降低42.70%、61.62%和60.98%，3組與陰性對(duì)照組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.01，圖1D)。

圖1 PM2.5處理HK-2細(xì)胞后MDA、SOD、GSH和GSH-PX的變化

2.2 細(xì)胞凋亡情況的變化

如圖2所示，HK-2細(xì)胞經(jīng)過(guò)24 h處理后，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，深圳PM樣品組、太原PM樣品組和陽(yáng)性對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率分別升高197.25%、301.22%和399.08%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05或

P

<0.01)。

圖2 PM2.5處理HK-2細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響

3 討論

根據(jù)全球疾病負(fù)擔(dān)研究，2015年環(huán)境PM的暴露導(dǎo)致了全球420萬(wàn)人死亡。在中國(guó)，100多萬(wàn)人的死亡可歸因于PM的暴露。Huang等在一項(xiàng)國(guó)家橫斷面研究中發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期暴露于濃度范圍較廣的PM與慢性腎臟疾病患病率增加存在相關(guān)性。也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)室外空氣污染與腎癌的發(fā)生有著密切聯(lián)系。以往關(guān)于PM對(duì)腎臟毒性的研究大多為對(duì)大鼠進(jìn)行急性或亞急性染毒，很少有低濃度PM對(duì)腎細(xì)胞進(jìn)行處理探討氧化損傷和凋亡的研究，因此本研究針對(duì)HK-2細(xì)胞PM處理前后氧化損傷和凋亡情況進(jìn)行了測(cè)定。

在正常生理情況下，機(jī)體內(nèi)的氧化和抗氧化防御系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)外界有害因素作用于機(jī)體時(shí)，平衡遭到破壞，ROS產(chǎn)生過(guò)多、脂質(zhì)過(guò)氧化，并最終對(duì)機(jī)體細(xì)胞、組織造成損傷，激活促腫瘤原性信號(hào)傳導(dǎo)，增強(qiáng)細(xì)胞存活和增殖并造成DNA損傷。機(jī)體通過(guò)酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，后者能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，并因此形成脂質(zhì)過(guò)氧化物，其中的MDA含量可以反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，即受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，MDA含量越高可以間接反映出細(xì)胞損傷程度越大。SOD能清除超氧陰離子自由基保護(hù)細(xì)胞免受損傷，對(duì)機(jī)體的氧化和抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，SOD活性的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力，SOD的活性越低代表細(xì)胞的抗氧化能力越差。GSH是機(jī)體內(nèi)最重要的非酶性抗氧化物，具有清除自由基、解毒、促進(jìn)鐵質(zhì)吸收及維持紅細(xì)胞膜的完整性、維持脫氧核糖核酸的生物合成、細(xì)胞的正常生長(zhǎng)發(fā)育及細(xì)胞免疫等多種重要生理功能，GSH含量是衡量機(jī)體抗氧化能力的重要因素，GSH含量越低同樣代表機(jī)體抗氧化能力越差。GSH-PX可以起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用，如果GSH-PX含量降低，將無(wú)法正常消除氧自由基及保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷。此前鮮有關(guān)于PM處理HK-2細(xì)胞發(fā)生氧化損傷以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的相關(guān)研究報(bào)道，而Cr已經(jīng)被證實(shí)可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷和凋亡，因此本研究中選擇Cr處理的HK-2細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照組來(lái)幫助我們了解PM是否可以誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷和細(xì)胞凋亡。查閱文獻(xiàn)后我們選取了4個(gè)可以反映細(xì)胞氧化損傷情況的經(jīng)典指標(biāo)即MDA、SOD、GSH和GSH-PX，各處理組與對(duì)照組相應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行比較，若指標(biāo)變化情況同陽(yáng)性對(duì)照組變化情況類(lèi)似，我們則認(rèn)為PM可以導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生氧化損傷。本研究發(fā)現(xiàn)：與陰性對(duì)照組相比，深圳、太原市PM樣品組和陽(yáng)性對(duì)照組MDA含量依次升高，SOD活性、GSH含量和GSH-PX活性依次降低，該結(jié)果種變化情況與PM致其他細(xì)胞系氧化損傷的結(jié)果相同。本研究結(jié)果顯示Cr具有導(dǎo)致HK-2細(xì)胞發(fā)生氧化損傷的作用，深圳市和太原市PM均可引起HK-2氧化損傷指標(biāo)發(fā)生與Cr處理后相類(lèi)似的變化，說(shuō)明兩市PM都可以導(dǎo)致HK-2細(xì)胞發(fā)生氧化損傷，且太原市PM的作用強(qiáng)于深圳市PM。

細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的自主有序的細(xì)胞死亡。它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等作用，是細(xì)胞適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)爭(zhēng)取的一種死亡過(guò)程。細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖都是生命的基本現(xiàn)象，在胚胎發(fā)育階段細(xì)胞凋亡可以清除多余的和已完成使命的細(xì)胞，保證胚胎正常發(fā)育；在成年階段細(xì)胞凋亡可以清除衰老和病變的細(xì)胞，保證機(jī)體健康。迄今為止凋亡過(guò)程確切機(jī)制尚不完全清楚，但當(dāng)射線、藥物或者發(fā)生腫瘤、自身免疫性疾病時(shí)凋亡過(guò)程會(huì)發(fā)生紊亂。本研究發(fā)現(xiàn)，兩市PM樣品組細(xì)胞相較于陰性對(duì)照組凋亡率均增加，說(shuō)明深圳和太原市PM可以誘導(dǎo)正常腎細(xì)胞發(fā)生凋亡。氧化應(yīng)激不僅與疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，并且與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系。PM可以通過(guò)引起腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)加重進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞損傷并且導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，在致氧化損傷和致凋亡兩個(gè)方面，太原市PM作用均強(qiáng)于深圳市PM。細(xì)顆粒物含有多種危害人體健康的物質(zhì)，其中包括部分具有致突變和致癌作用的重金屬和多環(huán)芳烴類(lèi)(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)有機(jī)污染物。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)PM成分進(jìn)行了檢測(cè)分析，利用氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定深圳市(南方城市)和太原市(北方城市)在2018—2019年間PM中16種多環(huán)芳烴的含量，發(fā)現(xiàn)太原PM多種PAHs濃度均高于深圳，特別是苯并(b)熒蒽、苯并(a)芘等顯著高于深圳(P<0.01)。PAHs進(jìn)入人體會(huì)經(jīng)過(guò)代謝產(chǎn)生可與DNA共價(jià)結(jié)合形成DNA加合物的代謝物，之后在人體進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化形成大量活性氧，造成DNA氧化性損傷進(jìn)而誘導(dǎo)癌癥的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)室前期測(cè)定2017—2018年深圳和太原市PM中的金屬元素，發(fā)現(xiàn)深圳市和太原市PM中排名靠前的金屬元素有Al、Pb、Mn、Cr、Cu、V、Ce、As、Ni等，其中太原市PM中的Pb、Al、As、Ni和Mn含量均高于深圳市PM(P<0.05)。As、Ni、Cr與多種癌癥有關(guān)，并且具有明顯致癌致突變作用，這提示持續(xù)暴露于空氣中低濃度的PM可對(duì)人體健康產(chǎn)生危害。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PM處理后可引起腎HK-2細(xì)胞發(fā)生氧化損傷以及凋亡，PM可能通過(guò)致細(xì)胞氧化損傷和凋亡的方式發(fā)揮細(xì)胞毒性。本研究結(jié)果為今后深入探討PM對(duì)腎臟的損傷提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。