楊荔艷，劉奏，郝佳潔，張鈺，，王明榮，

(1.國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院檢驗科，北京100021；2.國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院，分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室，北京100021)

食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是我國高發(fā)且預(yù)后較差的惡性消化道腫瘤，其發(fā)病率位居我國惡性腫瘤的第3位，死亡率位居第4位，嚴(yán)重威脅我國人民的健康甚至生命。食管鱗癌患者死亡率高的原因，一方面在于食管鱗癌患者早期階段常無任何癥狀，且相當(dāng)比例的患者在確診時已無法切除或已出現(xiàn)影像學(xué)可見的轉(zhuǎn)移灶，而發(fā)生轉(zhuǎn)移的晚期食管鱗癌患者未經(jīng)藥物治療的中位生存時間小于6個月，使用一線化療藥物治療后的中位生存時間也僅為8~13.8個月。因此，研究發(fā)現(xiàn)食管鱗癌中特異的分子標(biāo)志，建立有效的診斷方案，將有助于提高早期食管鱗癌患者的檢出率，從而降低其死亡率。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)p62在食管鱗癌細(xì)胞的細(xì)胞漿中表達(dá)，而在正常食管細(xì)胞中定位于細(xì)胞核，即存在明顯的核漿易位，尤其是在約30%的T1N0M0期的食管鱗癌組織中可以觀察到p62在癌細(xì)胞漿中表達(dá)，表明p62的核漿易位在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中是一個早期事件，有可能作為食管鱗癌早期診斷的分子標(biāo)志。進(jìn)一步的功能研究表明，細(xì)胞漿表達(dá)的p62顯著增強(qiáng)食管鱗癌細(xì)胞的抗凋亡能力。

p62(sequestosome-1，SQSTM1)是一種多功能的泛素化結(jié)合接頭蛋白，包括PB1、ZZ、TB、LIR、KIR及UBA多個結(jié)構(gòu)域，以及兩個核定位信號(nuclear localization signal，NLS)和一個核輸出信號(nuclear export signal，NES)。多項研究表明，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞的自噬水平下降，目前已在肺癌、乳腺癌、甲狀腺癌和結(jié)腸癌等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了p62的高表達(dá)。特別地，胞漿中p62的積累是預(yù)測前列腺癌患者不良預(yù)后的獨立因素，這與我們在食管鱗癌中的發(fā)現(xiàn)一致。

p62在食管鱗癌中發(fā)生核漿易位的分子機(jī)制目前尚無文獻(xiàn)報道，我們推測p62在食管鱗癌細(xì)胞中出現(xiàn)核漿易位也可能與核定位信號或者核輸出信號相關(guān)位點的磷酸化狀態(tài)相關(guān)。本研究基于前期研究結(jié)果和文獻(xiàn)報道，首先通過構(gòu)建p62不同磷酸化突變體，并將其轉(zhuǎn)至KYSE30細(xì)胞和內(nèi)源性敲降p62的KYSE150細(xì)胞中，研究p62磷酸化狀態(tài)與其核漿定位的關(guān)系；進(jìn)一步通過Co-IP、PLA實驗，初步探索可能影響p62磷酸化的激酶。本研究結(jié)果將為深入了解p62在食管鱗癌細(xì)胞中核漿易位的分子機(jī)制提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

p62抗體購于MBL，GSK-3β抗體購于CST，GFP和GAPDH抗體均購于Proteintech。引物由北京天一輝遠(yuǎn)公司合成，定點突變試劑盒KOD Plus Mutagenesis Kit購于TOYOBO公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購于Invitrogen公司，Protein A/G磁珠購于MCE公司，鄰位連接實驗試劑盒購于Sigma公司。

主要儀器包括激光共聚焦顯微鏡(PerkinElmer)，電泳儀(BIO-RAD)，電轉(zhuǎn)儀(Tanon天能)，微板分光光度計(BioTek Instruments)。

1.2 細(xì)胞系及培養(yǎng)條件

食管鱗癌細(xì)胞系KYSE30、KYSE70、KYSE150和KYSE510由日本京都大學(xué)Shimada教授惠贈，用于包裝慢病毒的人胚腎細(xì)胞株HEK293FT由本實驗室保存，以上細(xì)胞均經(jīng)過短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)驗證。食管鱗癌細(xì)胞系使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、CO體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HEK293FT細(xì)胞使用含10%胎牛血清、1%L型谷氨酰胺、1%非必需氨基酸以及1%遺傳霉素G418的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 免疫熒光實驗

選取前期報道的p62內(nèi)源性高表達(dá)的食管癌細(xì)胞(KYSE150，KYSE510及KYSE70)，將細(xì)胞接種至玻片上，同時設(shè)置實驗組和對照組，細(xì)胞貼壁后，實驗組加入1 μmol/L核輸出抑制劑KPT330，對照組加入等體積的溶劑處理30 min。然后棄去原培養(yǎng)基并使用PBS清洗，經(jīng)過4%多聚甲醛固定和5%BSA封閉后，使用p62一抗進(jìn)行孵育，再用FITC標(biāo)記的二抗進(jìn)行免疫熒光染色，DAPI復(fù)染標(biāo)記細(xì)胞核，利用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.4 磷酸化質(zhì)譜鑒定

培養(yǎng)并收集足量的KYSE510細(xì)胞，加入SDT裂解液，超聲裂解細(xì)胞(超聲條件：80 W，工作10 s，間歇15 s，循環(huán)10次)；沸水浴15 min，14 000 r/min離心40 min，取上清，BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，分裝樣品，-80℃保存，送中科新生命科技公司進(jìn)行LC-MS/MS鑒定；取400 μg蛋白進(jìn)行酶解，然后使用Anti-Anti-P-Tyr antibody beads富集磷酸化肽段；獲得的酶解產(chǎn)物使用Maxquant軟件(版本號1.3.0.5)對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行查庫，分析質(zhì)譜獲得的肽段所對應(yīng)的蛋白以及磷酸化位點。

1.5 定點突變體構(gòu)建

按照常規(guī)載體構(gòu)建方法首先構(gòu)建pEGFP-C1-p62蛋白全長真核表達(dá)載體，然后以此載體為基礎(chǔ)按照KOD Plus Mutagenesis Kit(TOYOBO)定點突變試劑盒說明書分別將p62蛋白的T269/S272/S328/S332位點突變成谷氨酸(Glu，E)使其處于持續(xù)磷酸化狀態(tài)，或突變?yōu)楸彼?Ala，A)使其保持去磷酸化狀態(tài)，構(gòu)建出p62不同磷酸化狀態(tài)的真核表達(dá)載體。構(gòu)建突變體的引物序列(5′-3′)如下：T269A上游GCACCCGTCTCTC CAGAGAGTTCCAGCA；T269E上游GAACCCGTCTCT CCAGAGAGTTCCAGCA；T269下 游CAGGCGGCTTC TTTTCCCTCCGTGC。S272A上 游GCACCAGAGAGTT CCAGCACAGAGGAGA；S272E上游GAACCAGAGAG TTCCAGCACAGAGGAGA；S272下 游GACGGGGGTC AGGCGGCTTCTTTTC。S328A上 游GCAGATAACTGT TCAGGAGGAGATGATG；S328E上 游GAAGATAACT GTTCAGGAGGAGATGATG；S328下游CTCCATCTGT TCCTCAGGGCGCCCC。S332A上 游GCAGGAGGAGAT GATGACTGGACCCATC；S332E上游5GAAGGAGGAGA TGATGACTGGACCCATC；S332下 游ACAGTTATCCG ACTCCATCTGTTCC。

1.6 慢病毒包裝及感染

按照常規(guī)載體構(gòu)建方法首先將針對p62 UTR1序列的shRNA寡核苷酸構(gòu)建至PLKO.1載體上，鑒定獲得PLKO.1-shp62質(zhì)粒。shRNA寡核苷酸由天一輝遠(yuǎn)公司合成，序列(5′-3′)如下：上游CCGGTGCCTAATGG CTTTCACTTTCCTCGAGGAAAGTGAAAGCCATTAGGC ATTTTT；下 游-AATTAAAAATGCCTAATGGCTTTCA CTTTCCTCGAGAAAGTGAAAGCCATTAGGCA。

將HEK293FT細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16~18 h，使細(xì)胞匯合度達(dá)到70%；利用轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000將慢病毒的包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G以及PLKO.1-shp62質(zhì)粒按照3 μg：3 μg：6 μg的比例共同轉(zhuǎn)染至KEK293FT細(xì)胞中；轉(zhuǎn)染完成后，每隔24 h收集一次病毒上清，共收集兩次，然后使用0.22 μm濾膜將病毒上清過濾，分裝后置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將生長狀態(tài)良好的食管鱗癌細(xì)胞接種至6孔板中，細(xì)胞貼壁后匯合度約50%；然后棄去原培養(yǎng)基，更換為1 mL新鮮的完全培養(yǎng)基，加入0.5 mL病毒上清和8 μg/mL的polybrene進(jìn)行感染；感染12 h后，棄去含病毒的培養(yǎng)基，更換為含嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基，進(jìn)行抗性篩選，獲得穩(wěn)定敲降p62的食管鱗癌細(xì)胞。

1.7 免疫共沉淀實驗

收取足量的食管鱗癌細(xì)胞，使用非變性裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度；取1 mg總蛋白平均分為兩份，一份加入p62抗體(購自于MBL)，另一份加入等量的與p62同一種屬來源的正常同型IgG(購自于CST)，4℃孵育過夜；然后加入50 μL proteinA/G磁珠(購自于MCE)，4℃孵育1 h，經(jīng)磁性分離后獲得復(fù)合物；將沉淀用20 μL 3X SDS上樣緩沖液重懸，置于95~100℃金屬浴中加熱2~5 min，12 000 r/min離心1 min獲得蛋白上清以進(jìn)行后續(xù)的Western blot實驗。

1.8 鄰位連接實驗

按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。細(xì)胞接種同免疫熒光實驗，然后細(xì)胞爬片依次經(jīng)固定、封閉、一抗孵育、探針孵育、連接、擴(kuò)增后固定于載玻片上，使用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

2.1 p62是一個具有核漿穿梭功能的蛋白

免疫熒光實驗結(jié)果(圖1)顯示，食管鱗癌細(xì)胞經(jīng)核輸出抑制劑KPT330處理30 min后，綠色熒光信號(p62)即轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，而對照組綠色熒光信號一直分布在細(xì)胞漿。說明食管鱗癌細(xì)胞在被核輸出抑制劑處理前后，p62蛋白存在由細(xì)胞漿到細(xì)胞核的易位。

圖1 利用核輸出抑制劑處理后，p62聚集在細(xì)胞核

2.2 p62蛋白的磷酸化狀態(tài)與其核漿定位相關(guān)

我們選取前期報道的p62內(nèi)源性高表達(dá)的KYSE510細(xì)胞進(jìn)行了磷酸化質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)在KYSE510細(xì)胞系中p62蛋白存在T269/S272/S328/S332共4個位點的磷酸化(圖2)，其中T269/S272位于核定位信號(NLS2：261~272)內(nèi)，S328/S332位于出核信號(NES：302~320)附近。

圖2 食管鱗癌細(xì)胞中存在T269/S272/S328/S332共4個位點的磷酸化

我們將不同位點磷酸化的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染至p62內(nèi)源性低表達(dá)的KYSE30細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h后，通過免疫熒光實驗結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)AAAA處理組(4個位點全部非磷酸化)信號定位在細(xì)胞漿，AAEE(269/272位點非磷酸化，328/332位點磷酸化)處理組定位在細(xì)胞漿，EEAA(269/272位點磷酸化，328/332位點非磷酸化)處理組定位在細(xì)胞核，EEEE處理組(4個位點全部磷酸化)定位在細(xì)胞漿(圖3A)。同時，為了排除內(nèi)源性p62的影響，我們通過慢病毒包裝系統(tǒng)，篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)p62不同磷酸化狀態(tài)的細(xì)胞株。免疫熒光實驗結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)在內(nèi)源性p62穩(wěn)定敲降的細(xì)胞中p62的核漿定位情況與KYSE30細(xì)胞的結(jié)果一致(圖3B)。

圖3 T269/S272/S328/S332的磷酸化狀態(tài)影響p62蛋白的核漿定位

2.3 GSK-3β可能是影響p62磷酸化的激酶

我們分析發(fā)現(xiàn)，p62的S328/S332位點的序列S328-D-N-C-S332，與GSK-3β磷酸化底物基序S/TX-X-X-Sp匹配。因此，我們利用Co-IP實驗檢測了p62與GSK-3β的相互作用情況，結(jié)果顯示p62和GSK-3β存在同一復(fù)合物中(圖4A)。我們進(jìn)一步通過鄰位連接技術(shù)分析了KYSE150細(xì)胞中p62與GSK-3β的相互作用方式，激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，使用p62與GSK-3β抗體共同孵育細(xì)胞后出現(xiàn)紅色的陽性信號，即產(chǎn)生了鄰近效應(yīng)。以上結(jié)果說明，p62與GSK-3β存在直接的相互作用。

圖4 p62與GSK-3β存在直接的相互作用

3 討論

p62目前已被證實是一種致癌蛋白，其高表達(dá)在腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控、增殖、凋亡、侵襲、遷移等過程中發(fā)揮重要作用，具有腫瘤診斷、預(yù)后判斷、治療監(jiān)測等價值。我們前期研究發(fā)現(xiàn)p62在食管鱗癌細(xì)胞中存在明顯的核漿易位現(xiàn)象，本研究基于前期基礎(chǔ)，探討了p62在食管鱗癌細(xì)胞中發(fā)生核漿易位的可能的調(diào)控方式。有研究發(fā)現(xiàn)p62蛋白在宮頸鱗癌HeLa細(xì)胞中可以穿梭于細(xì)胞漿和細(xì)胞核之間，且這種現(xiàn)象受到核定位信號或其附近位點磷酸化的調(diào)控。我們推測p62在食管鱗癌細(xì)胞中出現(xiàn)核漿易位也可能與核定位信號或者核輸出信號相關(guān)位點的磷酸化狀態(tài)相關(guān)。我們通過磷酸化質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)在食管鱗癌細(xì)胞中p62蛋白存在T269/S272/S328/S332等4個位點的磷酸化，其中T269/S272位于核定位信號(NLS2：261~272)內(nèi)，S328/S332位于出核信號(NES：302~320)附近。通過構(gòu)建這4個位點的磷酸化突變體，發(fā)現(xiàn)其磷酸化狀態(tài)與其出核和入核過程相關(guān)。特別地，T269/S272位點磷酸化、且同時S328/S332位點去磷酸化后，p62定位至細(xì)胞核中。說明在食管鱗癌細(xì)胞中，p62的磷酸化狀態(tài)確與其核漿定位相關(guān)，但是其磷酸化又受到何種分子的調(diào)控？從圖3結(jié)果看，S328/S332位點磷酸化對于p62的胞漿定位至關(guān)重要。關(guān)于S328/S332位點的磷酸化，迄今尚無研究報道，且無商售抗體。我們分析了p62蛋白發(fā)生磷酸化的序列，發(fā)現(xiàn)包含S328/S332位點的序列S328-D-N-C-S332，與GSK-3β的磷酸化底物基序S/T-X-X-X-Sp相互匹配。GSK-3β是一種保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于GSK-3激酶中的一種亞型，可以磷酸化多種底物，影響增殖、代謝、DNA修復(fù)等多個生物學(xué)過程。在作用機(jī)制上，GSK-3β可以通過介導(dǎo)AMPK通路抑制自噬而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移能力；通過激活A(yù)kt/GSK-3β/Nrf2通路，提高細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力；通過抑制細(xì)胞自噬，增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌的放療敏感性，因而是一個潛在的治療靶點。因此，我們首先利用Co-IP實驗證實p62與GSK-3β存在相互作用，進(jìn)一步利用PLA實驗明確p62是否為直接的底物與GSK-3β相互結(jié)合。PLA技術(shù)是一種特殊的免疫分析方法，可將蛋白信號放大1 000倍，檢測兩個蛋白最大距離為30 nm，是驗證兩個分子直接相互作用的最有效手段，可作為兩個蛋白質(zhì)之間相互作用的定性依據(jù)。本研究結(jié)果顯示，p62與GSK-3β蛋白存在鄰近效應(yīng)，即二者為直接的相互作用，據(jù)此我們推測GSK-3β有可能是調(diào)控p62蛋白S328/S332位點磷酸化的潛在激酶。

綜上所述，本研究在食管鱗癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)p62蛋白S328/S332位點磷酸化狀態(tài)影響其核漿定位，且可能是由激酶GSK-3β調(diào)控的，這些發(fā)現(xiàn)對于深入認(rèn)識p62在食管鱗癌中的作用具有重要意義。