胡培麗，阮浩瀾，賀抒，張楊，李波，邢書霞，孫磊，王鋼力，

(1.中國食品藥品檢定研究院，北京100050；2.廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣東廣州510663；3.成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，四川成都610000)

小鼠局部淋巴結(jié)試驗(yàn)(local lymph node assay，LLNA)是皮膚致敏多種替代方法中應(yīng)用最為廣泛的方法之一，Takeyoshi等建立了基于摻入溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)和酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)的LLNA改良方法(LLNA:BrdU-ELISA)，用示蹤劑替代放射性標(biāo)記物。LLNA和LLNA:BrdU-ELISA方法中均推薦使用CBA/JN小鼠，該品系小鼠在國內(nèi)供應(yīng)較少，價(jià)格昂貴；而BALB/c小鼠遺傳穩(wěn)定，在國內(nèi)應(yīng)用廣泛，前期研究結(jié)果表明兩品系小鼠只是反應(yīng)程度有一定的差異，對化學(xué)物和化妝品致敏性判斷及致敏強(qiáng)度分級并無顯著影響。由于傳統(tǒng)致敏性試驗(yàn)要避免受試物出現(xiàn)過度的皮膚刺激反應(yīng)，因此本研究應(yīng)用BALB/c小鼠LLNA:BrdU-ELISA方法對22種化學(xué)物和5種化妝品的皮膚刺激性和致敏性同時(shí)進(jìn)行檢測，并與相關(guān)傳統(tǒng)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，進(jìn)一步對該方法進(jìn)行評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 受試物

溶劑為丙酮/橄欖油(acetone/olive oil，AOO)[按4∶1(V/V)配制而成]、丙酮(acetone，ACE)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)或蒸餾水。2,4-二硝基氯苯、間苯二甲酸二甲酯、丁子香酚、異丁子香酚、3-氨基苯酚、反式肉桂醛、己基肉桂醛、水楊酸甲酯、香葉醇、對苯二酚、水楊酸己酯、水楊酸、甲醛、戊二醛、六水硫酸鎳、二氯化鈷、重鉻酸鉀和乳酸均購自Sigma公司；異丙醇、丙二醇、正己烷和苯購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。5種化妝品為超市隨機(jī)采購，標(biāo)識齊全，成分標(biāo)識清晰，使用說明明確。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級BALB/c小鼠，雌性，8～10周齡，由中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動物資源中心提供，合格證號為SCXK(京)2014-0013。動物試驗(yàn)環(huán)境為屏障系統(tǒng)動物房，使用許可證號為SYXK(京)20160004，溫度(22±2)℃，濕度40%～60%，動物自由飲食，12 h人工照明。

1.3 試劑和儀器

BrdU粉 劑、BrdU-ELISA試 劑 盒 購 自Roche公司，BrdU粉劑用生理鹽水配成10 mg/mL標(biāo)記液。SYNERGY HT全自動酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 動物分組和染毒

試驗(yàn)設(shè)溶劑對照組(AOO、ACE、DMSO或蒸餾水)，陽性對照組(25%己基肉桂醛)和受試物組，上述22種化學(xué)物用AOO、ACE或DMSO配成1~3個(gè)不同濃度，參照美國替代方法驗(yàn)證機(jī)構(gòu)間協(xié)調(diào)委員會(Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods，ICCVAM)，5種化妝品產(chǎn)品原液直接涂抹于小鼠雙側(cè)耳背，每組4只小鼠。于試驗(yàn)第1~3天上午9:00在小鼠雙耳背部分別涂抹受試物25 μL，溶劑對照組涂抹相應(yīng)溶劑，第4天不作處理，第5天腹腔注射BrdU標(biāo)記液0.5 mL。

1.4.2 取材

BrdU標(biāo)記液腹腔注射24 h后，摘取小鼠雙側(cè)耳朵，用直徑9 mm的打孔器進(jìn)行耳廓中央打孔稱取質(zhì)量，同時(shí)分離小鼠耳部雙側(cè)淋巴結(jié)，用天平稱量濕質(zhì)量。

1.4.3 淋巴細(xì)胞制備

雙側(cè)淋巴結(jié)用1 mL PBS研磨，200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，同時(shí)用1 mL PBS沖洗不銹鋼篩網(wǎng)，制成2 mL單細(xì)胞懸液，將每只小鼠的淋巴細(xì)胞用50 mL離心管定容于15 mL PBS中。

1.4.4 ELISA法檢測細(xì)胞增殖

將100 μL細(xì)胞懸液加入96孔板中，300 g離心10 min，棄上清，吹干細(xì)胞；加200 μL變性固定液，反應(yīng)30 min，棄去變性固定液；加100 μL抗-BrdU抗體工作液，室溫孵育90 min；棄掉未結(jié)合的工作液，用PBS洗液清洗3次，加底物顯色液100 μL，室溫反應(yīng)20 min，用酶標(biāo)儀測吸光度(發(fā)射波長、參考波長分別為370和492 nm)。

1.4.5 刺激指數(shù)、EC值計(jì)算與致敏性分級

刺激指數(shù)(stimulation index，SI)為受試物組BrdU標(biāo)記指數(shù)均值與溶劑對照組BrdU標(biāo)記指數(shù)均值的比值，SI≥1.6為致敏陽性。根據(jù)SI值估算SI為1.6時(shí)受試物的濃度(estimated concentration needed to produce an SIof 1.6，EC)，公 式 為：①EC=c+[(1.6-d)/(b-d)]×(a-c)(受試物3個(gè)濃度含SI>1.6和SI<1.6)；②EC=2(受試物3個(gè)濃度均為SI≥1.6)，其中a、c為相鄰兩點(diǎn)受試物的濃度，b、d為相應(yīng)SI值。致敏強(qiáng)度分級標(biāo)準(zhǔn)為：EC<0.1為極強(qiáng)，0.1≤EC<1.0為強(qiáng)，1.0≤EC<10為中，10≤EC<100為弱。

1.5 LLNA:BrdU-ELISA結(jié)果與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的比較

22種化學(xué)物和5種化妝品LLNA:BrdU-ELISA法BALB/c小鼠的致敏性檢測結(jié)果與LLNA:BrdU-ELISA法CBA小鼠、LLNA放射法、經(jīng)典豚鼠(guinea pig，GP)法及人體實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比較。

1.6 致敏性檢測結(jié)果評價(jià)分析

依據(jù)ICCVAM文獻(xiàn)中化學(xué)物的已知致敏性，評價(jià)BALB/c小鼠LLNA:BrdU-ELISA法致敏性檢測的陽性預(yù)測率、陰性預(yù)測率、假陽性率、假陰性率、靈敏度、特異度和準(zhǔn)確度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)數(shù)每劑量組小鼠的耳廓質(zhì)量、淋巴結(jié)質(zhì)量和BrdU標(biāo)記指數(shù)的均值與標(biāo)準(zhǔn)差，用

x

ˉ±

s

表示，用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間比較采用成組方差分析，以

α

=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，

P

<0.05為組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 22種化學(xué)物和5種化妝品皮膚刺激性

50%己基肉桂醛、5%二氯化鈷、10%乳酸、25%乳酸、50%乳酸組耳廓質(zhì)量與相應(yīng)溶劑對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05或

P

<0.01)，為刺激陽性，其他劑量組化學(xué)物均為刺激陰性。5種化妝品中，2號染發(fā)劑組耳廓質(zhì)量與溶劑對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)，為刺激陽性；其他化妝品均為刺激陰性(表1)。

表1 22種化學(xué)物和5種化妝品LLNA:BrdU-ELISA(BALB/c)法皮膚刺激性和致敏性測定結(jié)果

(續(xù)表1)

2.2 22種化學(xué)物和5種化妝品皮膚致敏性

2,4-二硝基氯苯、丁子香酚、異丁子香酚、3-氨基苯酚、反式肉桂醛、己基肉桂醛、香葉醇、對苯二酚、水楊酸己酯、甲醛、戊二醛、六水硫酸鎳、二氯化鈷、重鉻酸鉀、乳酸和2號染發(fā)劑為致敏陽性(SI>1.6)，致敏強(qiáng)度分級見表1；其他組SI值均小于1.6，為致敏陰性，見表1。

2.3 LLNA:BrdU-ELISA結(jié)果與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比較

查閱相關(guān)文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)，異丙醇LLNA法與GP豚鼠法均為致敏陰性，與本研究結(jié)果一致，但LLNA:BrdU-ELISA法CBA小鼠同時(shí)也有致敏假陽性結(jié)果，且人體實(shí)驗(yàn)為致敏陽性；正己烷LLNA:BrdU-ELISA法CBA小鼠檢測結(jié)果為致敏假陽性，而本研究BALB/c小鼠、LLNA放射法及人體實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為致敏陰性，較一致；乳酸LLNA放射法、豚鼠法及人體實(shí)驗(yàn)結(jié)果為致敏陰性，而LLNA:BrdU-ELISA法CBA小鼠結(jié)果為致敏陰性或陽性，而本研究BALB/c小鼠結(jié)果亦為致敏陽性，均為假陽性。苯為全新化學(xué)物，ICCVAM文獻(xiàn)中無相關(guān)致敏性數(shù)據(jù)。其他化學(xué)物BALB/c小鼠致敏結(jié)果均與相關(guān)文獻(xiàn)一致(部分化學(xué)物某些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)未知除外)，個(gè)別化學(xué)物致敏級別稍有差異。5種化妝品BALB/c小鼠致敏結(jié)果與傳統(tǒng)的豚鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。22種化學(xué)物和5種化妝品LLNA:BrdU-ELISA(BALB/c)法檢測的致敏性結(jié)果與LLNA:BrdU-ELISA(CBA)、LLNA放射法，經(jīng)典豚鼠法、人體試驗(yàn)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比較見表2。

表2 22種化學(xué)物和5種化妝品LLNA:BrdU-ELISA(BALB/c)法檢測的致敏性與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)的比較

2.4 致敏性檢測結(jié)果評價(jià)分析

苯為全新化學(xué)物，ICCVAM文獻(xiàn)中無相關(guān)致敏性數(shù)據(jù)。依據(jù)其他21種已知致敏性化學(xué)物，評價(jià)BALB/c小鼠LLNA:BrdU-ELISA法的致敏性檢測結(jié)果：陽性預(yù)測率為93.3%(14/15)、陰性預(yù)測率為100%(6/6)、假陽性率為14.3%(1/7)、假陰性為0(0/14)、靈敏度為100%(14/14)、特異性為85.7(6/7)、準(zhǔn)確度為95.2%(20/21)，見表3。

表3 BALB/c小鼠LLNA:BrdU-ELISA方法致敏性檢測結(jié)果評價(jià)分析

3 討論

由于實(shí)驗(yàn)動物的種屬、性別、年齡等因素會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果及評價(jià)體系，所以選擇合適的動物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)尤為重要。經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Co-operation and Development，OECD)指南(TG429、TG442)推薦CBA小鼠，但該品系小鼠在國內(nèi)使用量較少，繁殖周期較長、價(jià)格較高，不易推廣應(yīng)用；而BALB/c小鼠在國內(nèi)應(yīng)用較為廣泛，遺傳背景明確穩(wěn)定，是替代CBA小鼠的較好選擇。前期研究對兩品系小鼠LLNA:BrdU-ELISA法結(jié)果進(jìn)行了比較，結(jié)果表明兩個(gè)品系小鼠均可較好地評判化學(xué)物或化妝品的致敏性及致敏強(qiáng)度分級。

由于刺激物和致敏物均可對淋巴細(xì)胞產(chǎn)生增殖作用，從而致使LLNA產(chǎn)生假陽性，目前有研究通過增選刺激性指標(biāo)(耳廓質(zhì)量、耳厚差)對化學(xué)物的刺激性和致敏性進(jìn)行全面評價(jià)。但測量耳厚差主觀性較強(qiáng)，誤差較大，不易操作，所以本研究選用稱量耳廓質(zhì)量來評價(jià)受試物的刺激性。

本研究選用BALB/c小鼠LLNA:BrdU-ELISA法對22種化學(xué)物和5種化妝品進(jìn)行評價(jià)，通過耳廓質(zhì)量評價(jià)受試物的刺激性，通過淋巴結(jié)質(zhì)量、BrdU指數(shù)(SI)和EC評價(jià)受試物的致敏性及致敏強(qiáng)度。刺激性結(jié)果顯示50%己基肉桂醛、5%二氯化鈷、10%乳酸、25%乳酸、50%乳酸和2號染發(fā)劑為刺激陽性；而ICCVAM文獻(xiàn)中乳酸(≥10%，兔試驗(yàn))、己基肉桂醛(>10%，豚鼠試驗(yàn))和5%二氯化鈷(豚鼠試驗(yàn))為刺激陽性，2號染發(fā)劑傳統(tǒng)皮膚刺激性試驗(yàn)(兔)結(jié)果為刺激陽性；以上結(jié)果表明用耳廓質(zhì)量評價(jià)受試物的刺激性較為客觀、科學(xué)、準(zhǔn)確。

致敏性結(jié)果與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)比較：異丙醇與正己烷為非致敏物，本研究結(jié)果與LLNA發(fā)射法均為致敏陰性，而ICCVAM中CBA小鼠結(jié)果為致敏假陽性，表明LLNA:BrdU-ELISA法CBA小鼠反應(yīng)更為靈敏。前期兩品系小鼠比較研究中也發(fā)現(xiàn)CBA小鼠較BALB/c更高程度地?cái)z取BrdU，反應(yīng)程度有一定的差異，該發(fā)現(xiàn)與國際上相關(guān)學(xué)者對不同品系小鼠LLNA研究結(jié)果較一致。乳酸亦為非致敏物，但本研究與LLNA:BrdU-ELISA法CBA小鼠結(jié)果均為致敏假陽性，可能是乳酸的刺激性引起了淋巴細(xì)胞增殖，有待于進(jìn)一步分析淋巴細(xì)胞表型，并開展深入研究。

該方法陽性預(yù)測率為93.3%、陰性預(yù)測率為100%、假陽性率為14.3%、假陰性率為0、靈敏度為100%、特異性為85.7%、準(zhǔn)確度為95.2%，表明BALB/c小鼠LLNA:BrdU-ELISA法較好地評價(jià)了化學(xué)物/化妝品的皮膚致敏性，可在化妝品安全性評價(jià)中推廣應(yīng)用，發(fā)揮其重要作用。