蔣一飛,范坤,梅亞寧,劉成成(.宿州市第一人民醫(yī)院檢驗科,安徽宿州34000;.南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗學部,南京009)
奈瑟菌屬(Neisseria)目前包括28個菌種,大部分屬于人和動物黏膜正常菌群,其中約10余種可從人體分離[1]。除了淋病奈瑟菌和腦膜炎奈瑟菌,其他大多數(shù)與人類相關的奈瑟菌均是上呼吸道正常菌群,可引起機會性感染,常見有淺黃奈瑟菌(Neisseriaflavescens)、微黃奈瑟菌(Neisseriasubflava)、灰色奈瑟菌(Neisseriasubflava)、長奈瑟菌(Neisseriaelongata)等。其中,微黃奈瑟菌引起的感染報道較少,可造成患者腦膜炎、菌血癥等[2-4]。近來,宿州市第一人民醫(yī)院診治1例微黃奈瑟菌引起尿路感染合并菌血癥患者,報道如下。
患者男,76歲,因“進行性排尿困難半年,加重2 d伴發(fā)熱”于2019年7月14日入院?;颊甙肽昵盁o明顯誘因出現(xiàn)排尿困難,表現(xiàn)為尿頻、尿痛、排尿時間延長、夜尿增多。曾留置導尿治療,近2日來排尿困難明顯加重,伴有畏寒、發(fā)熱,最高體溫達40 ℃,遂就診于宿州市第一人民醫(yī)院泌尿外科。體格檢查:T:38.6 ℃,BP:171/100 mmHg,R:21次/min,雙肺呼吸音粗,未及干濕啰音;心率124次/min,律尚齊,心音可;腹平軟,無壓痛及反跳痛。前列腺約2度大,質(zhì)韌,飽滿,中央溝消失,未及硬結(jié),無觸痛。血常規(guī):WBC 15.08×109/L,N 90.40%,血降鈣素原(PCT)27.1 ng/mL;尿常規(guī):尿白細胞酯酶1+,尿WBC 25個/μL,尿隱血2+,尿紅細胞58個/μL。CT示:膀胱多發(fā)結(jié)石,左輸尿管下端結(jié)石伴左側(cè)腎盂輸尿管擴張;前列腺肥大伴鈣化。入院后采集血培養(yǎng)及中段尿培養(yǎng)均檢出微黃奈瑟菌。就診當日靜脈輸注頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)合左氧氟沙星經(jīng)驗性治療并留置導尿管。治療1周,患者發(fā)熱癥狀消除,且尿液逐漸由渾濁變至澄清。而后,行左側(cè)輸尿管鏡碎石取石術+經(jīng)尿道膀胱碎石取石術,術后恢復良好,予以出院。
2.1細菌培養(yǎng) 患者入院后,隨即送檢血培養(yǎng)(需氧瓶和厭氧瓶各1瓶)和中段尿培養(yǎng)。血培養(yǎng)采用美國BD公司BactecTMFX400血培養(yǎng)儀進行,需氧瓶培養(yǎng)18 h報陽性,厭氧瓶培養(yǎng)5 d未報陽性。陽性瓶涂片革蘭染色(珠海貝索公司)見革蘭陰性雙球菌,成對排列(圖1A)。轉(zhuǎn)種血瓊脂平板和巧克力平板(鄭州博賽公司),置35 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h見直徑1~2 mm、黃色、圓形、半透明、光滑、反光、邊緣整齊、黏稠小菌落(圖1B、C),菌落涂片革蘭染色同陽性瓶結(jié)果(圖1D)。中段尿接種血瓊脂平板和麥康凱平板,置35 ℃培養(yǎng)箱24 h,血瓊脂平板可見細菌生長(菌落計數(shù)>105個/mL),菌落形態(tài)及革蘭染色結(jié)果同血培養(yǎng)結(jié)果,而麥康凱平板未見細菌生長。血培養(yǎng)和尿培養(yǎng)分離菌株分別命名為Strain B和Strain U。
2.2菌種鑒定
2.2.1生化鑒定 2株細菌觸酶試驗、氧化酶試驗均陽性,氧化分解葡萄糖、麥芽糖、果糖,不分解乳糖、蔗糖。用法國生物梅里埃Vitek 2 Compact配套NH卡鑒定,結(jié)果均為干燥奈瑟菌(Neisseriasicca),鑒定率和生物編碼分別為93%和0637410010、98%和0633400000。質(zhì)控菌株為嚙蝕艾肯菌ATCC BAA-1152。
2.2.2質(zhì)譜鑒定 用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)分析儀(法國生物梅里埃公司)鑒定,結(jié)果均為黃色/深黃/微黃奈瑟菌(Neisseriaflave/perflave/subflava),置信度:99.9%。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 8739。
2.2.316S rRNA基因測序 用16S rRNA基因測序法,通用引物(27F/1492R)合成及雙向基因測序由南京擎科生物公司完成。引物序列為:F:5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAGC-3′,R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對,Strain B與參比菌株微黃奈瑟菌(NR_041989.1)、深黃奈瑟菌(NR_117694.1)、黏膜奈瑟菌(NR_117696.1)的同源性為前3位,依次為99.85%、99.20%和98.26%;Strain U的比對結(jié)果為:微黃奈瑟菌(NR_041989.1)99.78%、深黃奈瑟菌(NR_117694.1)99.13%、黏膜奈瑟菌(NR_117696.1)98.19%。
2.2.450 S核糖體蛋白L6片段基因(fragment of the 50 S ribosomal protein L6,rplF)測序rplF基因擴增及比對參考Bennett等[5]建立的方法。引物合成及基因雙向測序由南京擎科生物公司完成。引物序列為:F:5′-CAGTGACTGTTCCCG
CTGGTGT-3′,R:5′-AGGYTCAGGAGKWCGGAAHG-3′。 測序結(jié)果顯示,Strain B與Strain U的rplF基因序列相同。經(jīng)PubMLST數(shù)據(jù)庫(https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_rmlst_seqdef_kiosk)比對,最佳匹配種屬為微黃奈瑟菌[BACT000035(rplF):823]。
2.3藥敏試驗 參照美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(CLSI) M45-A3卡他莫拉菌標準,選用M-H瓊脂培養(yǎng)基,用E-test(鄭州安圖生物公司)和K-B法(英國Oxoid公司)檢測菌株藥物敏感性,結(jié)果見表1。用頭孢硝噻吩法(法國生物梅里埃公司)檢測β-內(nèi)酰胺酶活性,結(jié)果均為陰性。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922與金黃色葡萄球菌ATCC 25923。
表1 2株細菌抗菌藥物敏感性試驗結(jié)果
本患者血液和尿液中分離的2株細菌最終鑒定為微黃奈瑟菌,且二者藥敏結(jié)果相近,提示來源可能相同。Janda等[6]曾報道1名先天性尿道結(jié)構(gòu)異常兒童患者,由于長期自行導尿發(fā)生微黃奈瑟菌引起的尿路感染。而本文報道該老年患者,不僅有泌尿道感染體征,還有菌血癥等全身癥狀。結(jié)合該患者泌尿系統(tǒng)結(jié)石、前列腺增生、留置導尿管的病史,我們推測經(jīng)泌尿道逆行感染的可能性大。
Vitek 2配套NH卡可提供部分奈瑟菌屬細菌的鑒定能力,但其鑒定范圍不包含微黃奈瑟菌,因此將其誤鑒定為干燥奈瑟菌,但干燥奈瑟菌常見菌落形態(tài)與微黃奈瑟菌相比較差異較大。干燥奈瑟菌多為干燥、有皺紋、灰白色菌落,而微黃奈瑟菌屬細菌多為光滑、產(chǎn)黃色素菌落。因此,隨后將2株細菌行質(zhì)譜鑒定,結(jié)果為黃色/深黃/微黃奈瑟菌。最近的基因組分析表明,微黃奈瑟菌應重新歸為微黃奈瑟菌屬的一個變種[7]。微黃奈瑟菌屬即包括上述黃色奈瑟菌、深黃奈瑟菌、微黃奈瑟菌。16S rRNA序列分析是奈瑟菌屬鑒定、分類的重要手段[8]。通過對2株細菌進行16S rRNA測序和核酸比對顯示符合率最高的為微黃奈瑟菌。然而,最高的前2位菌種(微黃奈瑟菌、深黃奈瑟菌)間比對符合率差異未超過0.8%,所以用16S rRNA測序方法尚不能準確鑒定到種。rplF基因已被證明在奈瑟菌屬鑒定中具有更高的分辨率[1]。rplF基因測序結(jié)果顯示,2株細菌測序結(jié)果相同且經(jīng)PubMLST數(shù)據(jù)庫比對的最佳匹配菌種為微黃奈瑟菌。此外,糖類利用試驗結(jié)果顯示,分離菌株分解葡萄糖、麥芽糖、果糖,不分解乳糖、蔗糖,與黃紅勛報道的結(jié)果一致[4]。而深黃奈瑟菌可分解蔗糖,所以可將深黃奈瑟菌排除。
目前CLSI尚無微黃奈瑟菌的藥敏推薦方法。本文試探性地對幾種臨床常用藥物進行敏感性試驗。結(jié)果顯示2株菌株的藥敏數(shù)據(jù)差異均在1~2個梯度以內(nèi),其中氨芐西林、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢曲松、亞胺培南和美羅培南具有較低的最低抑菌濃度(MIC)?;仡櫛纠颊叩闹委?,入院后經(jīng)驗性使用頭孢哌酮/舒巴坦治療后發(fā)熱癥狀迅速緩解。雖然左氧氟沙星的MIC值高達8.0 μg/mL,但其在尿液中的藥物濃度遠大于血藥濃度,仍可能會對尿路中微黃奈瑟菌有效。除外抗菌藥物治療,解除尿路梗阻并保持尿液引流通暢也是該病例治療成功的關鍵。綜合其他一些感染案例[3,9-10],微黃奈瑟菌的機會致病性感染可能與年齡、免疫力低下以及侵襲性操作有關。由于實驗條件限制,未使用脈沖場凝膠電泳(PFGE)、多位點序列分型(MLST)等分子生物學方法對2株細菌進行同源性分析。