張德雙 辛?xí)栽?趙 鴻 張鳳蘭 余陽俊 趙岫云 于拴倉 汪維紅 蘇同兵 李佩榮 盧桂香

（北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，北京 100097）

大白菜起源于我國，種質(zhì)資源豐富，生態(tài)類型繁多。雖然我國擁有紫色的蕓薹屬蔬菜資源，但是缺乏具有深紫色葉片的大白菜種質(zhì)，尤其匱乏葉片正面和背面均為深紫色的大白菜材料。紫色大白菜富含花青苷，具有抗氧化衰老、癌癥、動脈硬化，減少夜盲、近視，防止神經(jīng)紊亂、老年癡呆癥，增強機體免疫力等保健功能。隨著人們對美好、健康、高質(zhì)量生活方式的不斷追求，紫色大白菜因其色澤艷麗，富含花青苷等營養(yǎng)成分，日益受到消費者喜愛。

在高等植物中，以種間雜交和回交方法，將單個外源染色體附加到受體細胞所含的一整套染色體中，即可創(chuàng)制異源單體附加系（monosomic alien addition lines，MAALs）。異源單體附加系是闡明基因組結(jié)構(gòu)和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的有效工具，也是創(chuàng)制種質(zhì)材料的有效方法。

目前，紫色大白菜紫色性狀的來源主要有4種：紫色芥菜（孫日飛 等，2006；張德雙 等，2017）、紫色大白菜（張德雙 等，2007）、紫菜薹（張明科 等，2008）和紫紅色蕪菁（Hayashi et al.，2010）。韓國KWONNONG SEED 公司最早育成了紫色大白菜品種紫寶和紫裔，但由于紫寶和紫裔是不育系配制的品種，沒有花粉，無法自交，不能被利用。所以，國內(nèi)急需類似韓國紫色大白菜的資源材料。自2015 年開始，筆者利用大白菜15 綠1-1-26與深紫色芥菜進行種間雜交，創(chuàng)制出深紫色大白菜種質(zhì)15NG28（張德雙 等，2017）。本試驗繼續(xù)利用深紫色大白菜種質(zhì)15NG28 與普通綠色大白菜進行雜交，選留深紫色植株再自交、回交，經(jīng)染色體壓片觀察，篩選獲得純合的深紫色親本材料，為選育深紫色大白菜新品種奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料深紫色大白菜種質(zhì)15NG28 及其與綠色大白菜雜交F1中深紫色植株自交獲得的深紫色自交系17M-236、17M-237、17M-240、17M-241、17M-243、17M-244、17M-245、17M-247，子葉和真葉的正面、背面、葉脈均為深紫色，但葉柄的正面為深紫色，背面為綠色；普通綠色大白菜純合自交系5 個，分別為春大白菜2 個（15 綠1-1-25 和15 綠2-1-28），秋大白菜3 個（15-1208、16-1081 和16-1096），雜交種1 個（14-CK2-10），葉片均為綠色，帶有毛刺。所有材料均來源于北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心白菜課題組。

1.2 試驗方法

2016 年春季，種植深紫色大白菜15NG28 和普通綠色大白菜14-CK2-10、15 綠1-1-25、15 綠2-1-28，開花后采用人工剝蕾授粉的方法進行雜交，獲得F1。2017—2019 年，選留深紫色個體繼續(xù)進行自交，與綠色大白菜15-1208、16-1081、16-1096 雜交或回交。同時，從苗期到成株期連續(xù)調(diào)查雜交、自交、回交各世代中深紫色和綠色植株的數(shù)量。2020 年春季，利用穩(wěn)定遺傳的深紫色大白菜與綠色大白菜株系進行雜交，觀察后代深紫色的分離比例。2021 年春季，利用純合的深紫色株系相互雜交，配制8 個F1，秋季播種鑒定8 個F1的性狀表現(xiàn)。

2018 年，以細胞質(zhì)雄性不育系CMS96（綠色大白菜）為母本，與深紫色大白菜自交系17M-236、17M-237、17M-240、17M-241、17M-243、17M-244、17M-245、17M-247 進行雜交，選留深紫色植株的不育系，繼續(xù)與上述純合的深紫色株系進行回交，獲得深紫色大白菜細胞質(zhì)雄性不育系，并分別調(diào)查不育系×深紫色植株的雜交、回交后代中深紫色和綠色植株的數(shù)量。

對穩(wěn)定遺傳的深紫色大白菜株系（深紫色性狀不再分離）和后代性狀分離的深紫色大白菜株系染色體進行壓片觀察。在盛花期，取長度1～2 mm的花蕾，立刻固定于卡諾溶液（100%乙醇∶冰醋酸為3V∶1V）中，置于4 ℃條件下4 h 以上，將花蕾轉(zhuǎn)移到70%酒精中備用。取出花蕾中的花藥，浸潤到蒸餾水中，在室溫下放置30 min 以上。再將花藥放入含有2.5%纖維素和2%果膠酶的溶液中，置于37 ℃條件下2.5 h，再在蒸餾水中浸潤20 min。取出花藥置于載玻片上，用刀片搗碎，滴1滴DAPI 溶液，在顯微鏡下計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 深紫色15NG28 與綠色大白菜雜交F1 的性狀分析

由表1 可見，在以深紫色15NG28 為母本的雜交F1中，16M-170 和16M-171 均出現(xiàn)一定比例的深紫色植株，而在以普通綠色大白菜為母本的雜交F1（16M-172）中沒有發(fā)現(xiàn)深紫色植株。所有深紫色植株的葉片顏色均表現(xiàn)為深紫色，包括子葉和真葉的正面、背面、葉脈以及葉柄的正面全部為深紫色，但是葉柄背面為綠色，不存在中間的過渡紫色。說明以深紫色植株為雌配子體、綠色植株為雄配子體的雜交后代更容易出現(xiàn)深紫色基因型植株，但是深紫色和綠色植株的數(shù)量比沒有規(guī)律性，深紫色和綠色不存在顯隱性關(guān)系?？梢娚钭仙?5NG28 的紫色性狀不是簡單的質(zhì)量性狀或數(shù)量性狀。

表1 深紫色15NG28 與綠色大白菜雜交F1 的性狀表現(xiàn)

2.2 深紫色15NG28 雜交后代中深紫色植株自交、回交以及雜交后代的性狀分析

由表2～4 可見，在深紫色性狀出現(xiàn)分離的株系中，全部株系的深紫色與綠色的分離比例均不符合孟德爾遺傳規(guī)律，同時分離比例差異很大，且與自交、回交以及繁殖代數(shù)均沒有明顯的相關(guān)性。由表5 可見，深紫色BC1F3中，19M-617 深紫色株出現(xiàn)的比例最高，19M-639 深紫色株出現(xiàn)的比例最低。

表2 深紫色植株自交后代的性狀表現(xiàn)

表3 深紫色植株與綠色大白菜回交后代的性狀表現(xiàn)

表4 深紫色植株與綠色大白菜回交后再自交后代的性狀表現(xiàn)

表5 深紫色大白菜自交BC1F3 的性狀表現(xiàn)

2.3 純合深紫色植株的自交后代及與綠色大白菜雜交F1 的性狀分析

為了驗證大白菜深紫色性狀的穩(wěn)定性，將自交F4的17 個全紫株系繼續(xù)自交2 代，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有自交后代全部表現(xiàn)為深紫色，深紫色性狀不再分離。利用這17 個純合的深紫色株系與普通綠色大白菜進行雜交，共獲得14 個雜交F1株系。這14個F1株系的深紫色性狀依然分離，其中12 個株系出現(xiàn)深紫色和綠色的分離，深紫色植株占比最高的達到31.25%，2 個株系全部為綠色。2021 年8 月，鑒定純合深紫色親本間的雜交F1，結(jié)果8 個F1沒有葉色分離，全部表現(xiàn)為深紫色，這一結(jié)果充分說明本試驗獲得的深紫色大白菜親本可以應(yīng)用于新品種選育，配制深紫色的大白菜雜交種。

觀察深紫色大白菜苗期至抱球期的性狀，發(fā)現(xiàn)在深紫色大白菜自交、回交以及雜交后代中，所有的深紫色植株葉片顏色都呈現(xiàn)深紫色，包括子葉和真葉的正面、背面、葉脈以及葉柄的正面全部為深紫色，葉柄背面為綠色，無中間的過渡顏色（圖1）。

圖1 純合深紫色大白菜的性狀表現(xiàn)

2.4 純合深紫色大白菜轉(zhuǎn)育細胞質(zhì)雄性不育系CMS96 后代的性狀分析

由表6 可見，17 個純合深紫色大白菜與細胞質(zhì)雄性不育系CMS96 回交獲得的13 個BC1株系和46 個BC2株系中，均未出現(xiàn)全紫株系，但隨著回交代數(shù)的增加，深紫色植株所占比例逐步增加，如從BC1的5.26%～20.51%到BC2的3.70%～50.79%，再到BC3的12.12%～64.29%。由此推測，如果以純合深紫色大白菜株系為父本系，與深紫色CMS96 不育系進行多代回交，隨著回交代數(shù)的增加，可以獲得純合的深紫色不育系。

表6 純合深紫色大白菜轉(zhuǎn)育細胞質(zhì)雄性不育系CMS96后代的性狀表現(xiàn)

2.5 雜合深紫色植株和純合深紫色植株的染色體數(shù)

由上述研究發(fā)現(xiàn)，大白菜葉片深紫色性狀不符合孟德爾遺傳規(guī)律，也沒有明顯的規(guī)律性，推測深紫色植株和綠色植株比值的無規(guī)律性結(jié)果可能是由異源單體附加系導(dǎo)致的，即深紫色的出現(xiàn)可能是由于含有異源染色體附加系。

為了驗證該推斷，在顯微鏡下觀察穩(wěn)定遺傳和性狀分離的深紫色大白菜的染色體數(shù)差異。結(jié)果表明（圖2），性狀分離的深紫色大白菜16M-170-21所含的染色體數(shù)為21 條，而穩(wěn)定遺傳的深紫色大白菜20M-7 紫鑒所含的染色體數(shù)為22 條。

圖2 遺傳穩(wěn)定和性狀分離的深紫色大白菜染色體數(shù)

3 討論與結(jié)論

3.1 深紫色大白菜異源單體附加系的創(chuàng)制

本試驗結(jié)果表明，在深紫色大白菜細胞質(zhì)雄性不育系CMS96 雜交后代和純合深紫色大白菜×綠色大白菜雜交后代中，只發(fā)現(xiàn)了深紫色和綠色2 種顏色的基因型，并沒有中等紫色或淡紫色葉片的后代。充分說明本試驗創(chuàng)制的深紫色性狀不符合經(jīng)典的孟德爾規(guī)律，控制葉片深紫色的基因不具有顯隱性等特點。這一結(jié)論與張淑江（2014）得出的紫紅色大白菜自交系B90335-5 的紫紅色性狀不符合孟德爾遺傳規(guī)律一致。另外，染色體壓片觀察結(jié)果也表明，穩(wěn)定遺傳的深紫色大白菜的染色體數(shù)目增多。深紫色大白菜15NG28 是由綠色大白菜和深紫色芥菜種間雜交獲得的種質(zhì)材料（張德雙 等，2017），綠色大白菜的基因組為AA，而深紫色芥菜的基因組為AABB，兩者的A 基因組同源性較高，由此推測深紫色大白菜的附加系應(yīng)來源于B 染色體。為了進一步驗證異源單體附加系的試驗結(jié)論，筆者采用熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）進行驗證，15NG28 及其自交、雜交、回交后代中深紫色植株均為大白菜A 基因組附加黑芥B 基因組的異源單體附加系，純合基因型為20A+2B，雜合基因型為20A+1B（結(jié)果未列出）。

3.2 在深紫色植株的自交4 代中獲得了純合的深紫色大白菜

本試驗中，分別在深紫色大白菜F2、F3、F4、BC1F2、BC2F2、BC1F3和BC1F4中發(fā)現(xiàn)了2、3、17、1、3、3、17 株深紫色的大白菜材料；在自交4 代中，部分深紫色大白菜株系自交后代全部為深紫色，即全部株系的所有深紫色性狀不再分離。這一結(jié)果為轉(zhuǎn)育不同類型深紫色大白菜材料，快速獲得純合的深紫色大白菜親本提供了依據(jù)。誠然，考慮到深紫色大白菜為異源單體附加系材料，B 基因組的存在可能增加A 與A 基因組以及A 與B 基因組的交叉和置換，因此獲得多個性狀都純合的深紫色大白菜材料可能還需要再自交2 代或更多的代數(shù)。截至2020 年底，已獲得純合的深紫色大白菜材料17 份，菜薹（菜心）材料5 份。

3.3 控制深紫色大白菜的深紫色代謝調(diào)控途徑基因有待進一步研究

本試驗還發(fā)現(xiàn)，有些深紫色材料的自交后代純合速度快，由附加1 條B 基因組（染色體數(shù)為21條）變?yōu)楦郊? 條B 基因組（染色體數(shù)為22 條）只需4 代，雖然很多材料也經(jīng)過同樣的自交4 代，但是染色體數(shù)依然還是21 條。同樣，雖然同是回交或雜交的后代材料，但是深紫色和綠色植株出現(xiàn)的比例差異很大，如19M-617 深紫色植株所占比率高達85.71%，遠高于相同代數(shù)的19M-639（深紫色植株所占比率僅為5.88%）。

理論上，假設(shè)綠色基因型為AA，產(chǎn)生10 個A 配子；純合深紫色基因型為AA+2B，產(chǎn)生10個A 和1 個B 配子；二者雜交F1的基因型應(yīng)該是AA+1B，F(xiàn)1的性狀應(yīng)該表現(xiàn)為深紫色。但是，本試驗中，綠色×純合深紫色或純合深紫色×綠色的雜交F1性狀都出現(xiàn)深紫色和綠色的分離，且深紫色所占的比例很低。同理，如果非純合深紫色的基因型為AA+1B，配子為10個A或10個A和1個B；綠色基因型為AA，產(chǎn)生配子為10 個A；二者雜交F1表現(xiàn)為綠色AA 和深紫色AA+1B，出現(xiàn)深紫色和綠色植株的隨機性很強?？紤]到異源附加系1 條B 基因組被A 基因組所排斥或滯后等原因，可能導(dǎo)致B 基因組在后代中更容易被拋棄，深紫色所占的比例應(yīng)該很少。但是實際上，深紫色所占的比例并沒有一定的規(guī)律，且隨著回交代數(shù)的增加，深紫色所占的比例有所提高。相反，純合的深紫色大白菜無論是自交還是雜交，其后代的紫色性狀都不再分離，這是由于B 基因組可以正常聯(lián)會、配對，均等分配到子代的緣故。由此說明，可能有某種機制控制異源B 基因組在后代中的傳遞、加倍和深紫色性狀遺傳等。深紫色大白菜的深紫色性狀可能是蕓薹種A 與黑芥B 基因組的相互影響，或者是B 基因組對A 基因組影響等所導(dǎo)致的結(jié)果。

3.4 異源單體附加系B 基因組對大白菜性狀的影響

本試驗發(fā)現(xiàn)，15NG28 與普通綠色大白菜雜交、回交后代分離出的深紫色植株子葉和真葉的正面、背面、葉脈以及葉柄的正面均表現(xiàn)為深紫色。與綠色大白菜相比，純合的深紫色大白菜除了深紫色性狀外，農(nóng)藝性狀主要表現(xiàn)在葉片數(shù)增多，抱球所需的時間稍長，葉球略松，球內(nèi)葉紫紅色，心葉淺黃色，花青苷成分增加。當然，B 基因組對大白菜其他性狀還應(yīng)該有影響。對純合深紫色大白菜與韓國紫色大白菜品種紫寶和紫裔的葉球剖面進行比較，發(fā)現(xiàn)3 份材料的葉球均為深紫色，心葉淺黃色，葉柄剖面為白色?？紤]到深紫色大白菜心葉淺黃色的特點，可以借鑒綠色大白菜與紫菜薹雜交、自交后篩選紫心大白菜的方法（張明科 等，2008；He et al.，2020），利用深紫色大白菜與紫心大白菜或者紫菜薹雜交、回交和自交，進一步獲得葉球剖面全部為深紫色的深紫色大白菜。