馬小超 張 慧 張淑江 李 菲 章時蕃 李國亮 劉希童 孫日飛

（中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

十字花科根腫?。╟lubroot disease）是由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicaeWoronin）引起的一種重要的世界性土傳病害（司軍 等，2002）。病菌通過侵染十字花科植物根毛導致根部薄壁細胞增生而形成腫瘤（阿歷索保羅 等，2002）。國內外學者已開展了以大白菜、甘藍等作物為研究對象的根腫病接種方法的研究（李曉鷗 等，1990；Asano et al.，1999，2006；司軍等，2003a，2003b；Siemens et al.，2009），以浸根法和注射法居多，但在接種方法的適宜條件上沒有進行深入的探討。本試驗在前人研究的基礎上，以大白菜根腫病高感品種菊心為試材，比較浸根法和注射法中根系浸泡時間、菌液注射量以及穴盤規(guī)格等因素對接種效果的影響，以期建立快速、穩(wěn)定的大白菜根腫病苗期抗性鑒定技術。

據(jù)統(tǒng)計，根腫病危害面積占十字花科作物總面積的1/3 以上，平均產量損失20%～30%，發(fā)病嚴重地塊損失可達60%以上（王靖 等，2012）。近年來，根腫病在湖北、云南、四川、貴州、浙江、福建等十字花科蔬菜種植區(qū)發(fā)生嚴重，已成為制約我國大白菜、甘藍、蘿卜等十字花科蔬菜生產的重要因素，其中尤以大白菜受害最為嚴重（李寶聚，2008；龍同 等，2010，2016）。防治根腫病的有效方法有撒石灰（Murakami et al.，2002；Hwang et al.，2011）、調節(jié)土壤pH、輪作等，其中選育抗病品種是最經濟、安全的手段（Howard et al.，2010）。但是不同地區(qū)根腫病菌生理小種變化較大，變異類型多，存在地區(qū)進化及分布的差異（Chai et al.，2014）。本試驗對15 個在生產上廣泛使用的大白菜抗根腫病品種進行多地區(qū)根腫病菌接種鑒定，旨在了解不同抗根腫病品種對不同來源地根腫病菌的抗性表現(xiàn)，推動抗根腫病大白菜品種的產業(yè)化應用，為大白菜抗病育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料均由中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所白菜課題組提供，大白菜根腫病高感品種菊心，對多個根腫病菌生理小種均表現(xiàn)高感（柴阿麗 等，2015）；15 個抗根腫病大白菜品種主要來源于中國、韓國、日本，具體品種名稱及特征特性詳見表1。

表1 供試大白菜品種名稱、來源及特征特性

供試根腫病菌取自北京順義、河南南陽和重慶武隆的田間發(fā)病腫根，洗凈后裝袋，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。北京順義、河南南陽根腫病菌由沈陽農業(yè)大學園藝學院蔬菜教研室于2020 年5 月采用Williams 鑒別系統(tǒng)鑒定為4 號生理小種；重慶武隆根腫病菌經丁云花等（2013）鑒定，同樣為4 號生理小種。

育苗基質在本所農場配制，泥炭土∶珍珠巖∶蛭石為2V∶1V∶1V，進行滅菌處理后備用。

1.2 試驗方法

試驗于2020 年4—8 月在本所南苑人工氣候室進行。

1.2.1 根腫病菌孢子懸浮液的制備 參考柴阿麗等（2015）的方法并略有修改。取-20 ℃冰箱保存的大白菜根腫組織，置于室溫條件下解凍，促使其休眠孢子萌發(fā)；用剪刀將其剪碎，與蒸餾水一起加入組織搗碎機，每15 g 根腫組織需100 mL 蒸餾水，打磨成漿后用8 層紗布過濾，棄掉濾渣；將濾液裝入50 mL 離心管中，4 ℃、3 000 r·min-1離心8 min，棄上清液，用蒸餾水懸浮沉淀，重復2次；利用湯麥式血球計數(shù)板計算休眠孢子懸浮液濃度，調節(jié)至每個中格含有240 個休眠孢子，即孢子懸浮液濃度為3×108個·mL-1，4 ℃保存，24 h 內使用。

1.2.2 注射接種法適宜接種條件的篩選 以根腫病高感品種菊心為試材，以北京順義根腫病菌為接種菌源，于2020 年4 月15 日在本所南苑人工氣候室進行試驗。先用刮板將滅菌后的育苗基質均勻裝入穴盤（規(guī)格為長54 cm，寬28 cm，高6 cm）中，采用壓穴器在每個穴孔中央按壓出1 cm 深的孔洞，澆透底水，然后人工點播菊心種子，每穴1～2 粒，播后覆蓋一薄層育苗基質與格室相齊平；播種后6 d 左右間苗，每穴保留1 株，幼苗兩葉一心期（播種后10 d 左右）使用10 mL 的一次性無菌注射器對幼苗根際注射根腫病菌孢子懸浮液。接種前1 d 澆透水，接種后3 d 內不能澆水；接種后的幼苗置于25～30 ℃人工氣候室內，16 h/8 h（晝/夜）光周期培養(yǎng)，穴盤底部墊有相同規(guī)格托盤，托盤中灌有pH=6 的鹽酸水，使基質含水量保持在90%以上；接種14 d 后撤掉托盤，之后按需澆水。接種40 d 后調查根腫病發(fā)病情況。

對注射量和穴盤規(guī)格進行篩選優(yōu)化，注射量設置1、2、3、5 mL 4 個水平，穴盤規(guī)格設置32、50、72 孔3 個水平，兩因素交互作用，共計12 個處理組合；以注射2 mL 無菌水、選用72 孔穴盤為對照，采用隨機區(qū)組排列，每處理45 株，3 次重復。

1.2.3 浸根接種法適宜接種條件的篩選 同樣以菊心為試材，以北京順義根腫病菌為接種菌源，2020年4 月15 日在本所南苑人工氣候室進行試驗。先在鋪有單層濾紙的培養(yǎng)皿中對菊心種子進行催芽，濾紙保持濕潤，室溫條件下催芽4～5 d；待根長約1 cm 時，移入裝有根腫病菌孢子懸浮液20 mL 的培養(yǎng)皿中，使根系完全浸沒，浸根一定時間后用鑷子夾取種芽根部，輕輕插入裝有無菌育苗基質的穴盤中。接種后的幼苗管理方法同1.2.2。接種40 d后調查根腫病發(fā)病情況。

對浸根時間和穴盤規(guī)格進行篩選優(yōu)化，浸根時間設置15 s 和5、15 min 3 個水平，穴盤規(guī)格設置32、50、72 孔3 個水平，兩因素交互作用，共計9個處理組合；以無菌水浸泡為對照，采用隨機區(qū)組排列，每處理45 株，3 次重復。

1.2.4 大白菜品種抗病性鑒定 2020 年7 月10 日在本所南苑人工氣候室，采用優(yōu)化后的浸根接種法對15 個抗根腫病大白菜品種進行接種鑒定，以北京順義、河南南陽和重慶武隆根腫病菌為接種菌源。每穴1 株，每份材料每處理10 株，2 次重復。接種方法同1.2.3，接種后幼苗管理同1.2.2。接種40 d 后調查根腫病發(fā)病情況。

1.3 根腫病病情分級標準

病情分級標準、病情指數(shù)計算方法及抗性評價標準參考Hui 等（2015）的方法。病情分級標準：0 級，根部無腫大現(xiàn)象；1 級，側根根部有少量小腫瘤；2 級，側根根部有較大腫瘤或主根上有小腫瘤；3 級，主根和側根都出現(xiàn)嚴重的腫大（圖1）?？剐栽u價標準：免疫（I），病情指數(shù)=0；高抗（HR），0 ＜病情指數(shù)≤11.11；抗病（R），11.11 ＜病情指數(shù)≤33.33；感?。⊿），33.33 ＜病情指數(shù)≤55.55；高感（HS），病情指數(shù)＞55.55。

圖1 大白菜苗期根腫病病情分級標準

病情指數(shù)=Σ（各級病株數(shù)×相對病級）/（調查總株數(shù)×最高病級）×100

發(fā)病率=（發(fā)病株數(shù)/總株數(shù)）×100%

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0 軟件處理試驗數(shù)據(jù)，應用Duncan 氏新復極差法進行顯著性檢驗，使用Excel 2013 軟件做圖。

2 結果與分析

2.1 注射接種法適宜接種條件的篩選

從表2 可以看出，在菌液注射量相同時，不同穴盤規(guī)格處理的大白菜根腫病病情指數(shù)和發(fā)病率均無顯著差異；3 個穴盤規(guī)格水平下，5、3、2 mL 菌液注射量處理的病情指數(shù)和發(fā)病率均顯著高于1 mL 注射量處理；當菌液注射量為2 mL 時，選用72 孔穴盤，發(fā)病率和病情指數(shù)最高，分別為97.92%和81.94。因此，推薦使用2 mL 菌液注射量和72 孔穴盤作為注射接種法接種大白菜根腫病菌的最佳方案。

表2 不同菌液注射量和穴盤規(guī)格對大白菜根腫病室內苗期人工接種鑒定效果的影響

2.2 浸根接種法適宜接種條件的篩選

由圖2 可知，浸根時間為15 min 和5 min 時，不同穴盤規(guī)格處理的大白菜根腫病病情指數(shù)均在80 以上，且處理間無顯著差異；浸根時間為15 s時，3 個穴盤規(guī)格處理的病情指數(shù)均顯著低于浸根15 min 和5 min 處理。比較而言，選擇浸根時間5 min 和任意穴盤規(guī)格，即可使幼苗完全發(fā)病且病情指數(shù)穩(wěn)定在80 以上。

圖2 不同浸根時間和穴盤規(guī)格對大白菜根腫病室內苗期人工接種鑒定效果的影響

2.3 不同大白菜品種抗病性鑒定結果

從表2、圖2 可以看出，相對于注射接種法，采用浸根接種法接種的大白菜根腫病病情指數(shù)更高、穩(wěn)定性更好，且節(jié)省菌液。因此，本試驗選用優(yōu)化后的浸根接種法對15 個抗根腫病大白菜品種進行接種鑒定，以菊心為感病對照。

從表3 可以看出，不同大白菜品種對同一來源地根腫病菌的抗性表現(xiàn)存在差異，且同一品種對不同來源地根腫病菌的抗性表現(xiàn)也不盡相同。15 個抗根腫病大白菜品種中，對河南南陽根腫病菌表現(xiàn)高感的品種有10 個，抗病的3 個，高抗的2 個；對北京順義根腫病菌表現(xiàn)高感的品種有7 個，感病的3 個，抗病的2 個，高抗的1 個，免疫的2 個；對重慶武隆根腫病菌表現(xiàn)高感的品種有6 個，感病的1 個，抗病的6 個，高抗的2 個?？共⌒员憩F(xiàn)較強（包括抗病、高抗、免疫）的品種在3 個不同菌源處理中所占比例分別為33.3%、33.3%和53.3%。從菌源致病力來看，河南南陽根腫病菌的致病力相對較強，重慶武隆根腫病菌的致病力較弱。

從表3 還可以看出，CR 惠民、CR 利民、德高CR117 均對三地菌源表現(xiàn)出較強的抗性，猜測這3 個品種含有多個微效抗病基因，具有廣譜抗性。其中，德高CR117 對北京順義根腫病菌表現(xiàn)免疫。而CR 福星、CR 美妮、CR 奈良、盛春以及高原綠等品種對三地菌源均表現(xiàn)為高感，猜測這5個品種可能不含抗根腫病菌4 號生理小種的基因。此外，部分參試品種具有垂直抗性特點，對某一來源地的根腫病菌具有專一抗性。如CR 高冷地、CR根寶、CR 金佰利、德高CR1138、根王、萬清克腫皇等品種對三地菌源的抗性表現(xiàn)差異較大，均存在抗病表現(xiàn)和感病表現(xiàn)，猜測這6 個品種的根腫病抗性由單個或者少個主效抗病基因控制。

表3 不同抗根腫病大白菜品種對3 個地區(qū)根腫病菌的抗性鑒定結果

本試驗中，來自本土產地的品種9 個，來自韓國的品種5 個，來自日本的品種1 個。韓國品種的抗、感表現(xiàn)差異較大，CR 利民和CR 惠民對三地菌源表現(xiàn)完全抗病，而其余品種表現(xiàn)全部感?。蝗毡酒贩NCR 奈良對三地菌源全部表現(xiàn)高感；本土產地品種中德高CR117 等7 個品種對三地菌源均有不同程度抗性。

3 討論與結論

根腫病菌的接種濃度是影響接種效果的重要因素。丁云花和簡元才（2005）、丁云花等（2013）在進行接種方法比較以及對8 個省市根腫病菌生理小種進行鑒定時分別選用2 mL 注射量、孢子濃度為1×108個·mL-1，或1 mL 注射量、孢子濃度為1×107個·mL-1的菌液接種，接種效果良好，植株穩(wěn)定發(fā)病。汪維紅等（2013）在對湖北長陽縣根腫病菌生理小種進行鑒定時選用1 mL 注射量、孢子濃度為1×107～1×108個·mL-1的菌液接種，結果穩(wěn)定可靠。柴阿麗等（2015）進行接種方法比較時則選用5 mL 的孢子濃度3×108個·mL-1菌液進行灌根接種，發(fā)病率和病情指數(shù)最高。朱紅芳等（2016）發(fā)現(xiàn)根腫病菌孢子濃度達到4×108個·mL-1時，發(fā)病率和病情指數(shù)開始降低。比較而言，本試驗為保證植株穩(wěn)定發(fā)病且減少根腫病菌濃度對其他因素的影響，選擇孢子濃度3×108個·mL-1為本試驗的菌液接種濃度。

針對注射法接種，對比張淑霞等（2010）1 mL 注射量的設置，且發(fā)病率及病情指數(shù)均較低的接種結果，本試驗設置了1、2、3、5 mL 注射量4個水平，旨在探索節(jié)約菌液且植株高效發(fā)病的最佳條件。試驗中觀察到，72 孔穴盤規(guī)格處理的大白菜根腫病發(fā)病率略高，2 mL 以上注射量發(fā)病效果顯著，且隨著注射量升高并無顯著變化。分析原因可能是穴孔較小，在注射菌液時容易使根系接觸到根腫病菌，感病率提高，并且注射量到達一定程度后基質中的菌液濃度趨于飽和。注射法中各處理標準差浮動不大，且2 mL 以上注射量病情指數(shù)與發(fā)病率相對于灌根法（朱紅芳 等，2016）較穩(wěn)定，可能是因為注射法相對于灌根法接種部位更精準。另外，相對于索歡等（2016）直接播種后進行注射，本試驗在幼苗兩葉一心期進行菌液注射的效果較好，因為該時期根毛較密集，可以更充分地與新鮮菌液接觸，促進根腫病菌對根毛的侵染。接種后3 d 內澆水可能會將基質中的新鮮根腫病菌沖洗掉，降低發(fā)病率。為保證萌發(fā)后的游動孢子侵染根毛，可在接種后前2 周將穴盤放入裝有適量鹽酸水的托盤中，加速游動孢子的移動，之后去掉托盤促進空氣流通，確保植株正常生長。

針對浸根法接種，結合李曉鷗等（1990）、Fredua-Agyeman 等（2020）關于浸根時間2～3 min和10～20 s 的描述，同時發(fā)現(xiàn)柴阿麗等（2015）設置的15、30、45、60 min 浸根時間梯度較長，且在浸根30 min 時發(fā)病率及病情指數(shù)也趨于平穩(wěn)，本試驗設置了15 s 和5、15 min 浸根3 個水平進行比較，發(fā)現(xiàn)浸根時間小于15 min 同樣具有較高的發(fā)病率和病情指數(shù)。采用浸根法接種時觀察到，根系浸泡5 min 以上的發(fā)病效果顯著高于浸泡15 s，且隨著浸根時間的延長，病情指數(shù)與發(fā)病率趨于平穩(wěn)，浸根5 min 時發(fā)病率即可達到100%。說明浸根時間越長，根系與菌液接觸越穩(wěn)定，且一段時間后根系完全被菌液包裹趨于飽和。浸根15 s 時，植株發(fā)病不穩(wěn)定，可能是浸根時間較短，菌液和根系的接觸不充分所致。

針對15 份大白菜品種的抗性鑒定試驗，接種方法采用了節(jié)約菌液且優(yōu)化后的浸根法。供試菌源采自河南南陽及重慶武隆發(fā)病嚴重地塊的大白菜生產田，北京順義根腫病菌采自本所試驗基地中發(fā)病的大白菜腫根（發(fā)病原因可能是育苗時期基質帶菌所致）。試驗中觀察到，雖然三地根腫病菌經鑒定均為4 號生理小種，但參試大白菜對三者的抗病性表現(xiàn)不一致，例如CR 高冷地、CR 根寶、CR 金佰利、德高CR1138、根王、萬清克腫皇等對三地根腫病菌的抗性表現(xiàn)均不相同。猜測可能的原因是Williams 鑒別系統(tǒng)具有一定局限性，無法將致病力更強的生理小種區(qū)分開來。CR 惠民、CR 利民和德高CR117 對三地菌源均表現(xiàn)出較強的抗性，其中德高CR117 對湖北枝江等8 個根腫病重發(fā)區(qū)（曾令益等，2017）及湖北長陽縣（汪維紅 等，2013）的根腫病菌同樣表現(xiàn)高抗性；CR 惠民在譚翀和岳艷玲（2013）的報道中對云南安寧、玉溪地區(qū)根腫病菌具有抗性；CR 利民同樣對多個地區(qū)根腫病菌具有抗性，例如山東青島、云南昆明等地（張淑霞 等，2018）。猜測這3 個品種含有多個抗病基因，因而對多個來源地的根腫病菌表現(xiàn)抗性。而CR 美妮和CR 福星對三地菌源均表現(xiàn)感病，且王新月（2017）同樣報道了這2 個品種對太白高山地區(qū)的根腫病菌4 號生理小種表現(xiàn)感病，說明CR 美妮與CR 福星可能不含抗根腫病菌4 號生理小種的基因。

不同大白菜品種抗性鑒定結果初步明確了部分抗病大白菜品種對3 個不同地區(qū)根腫病菌的抗性，為相應的抗病大白菜品種的利用提供了依據(jù)。今后還需對各地菌源的小種類型及相應抗病品種的抗病基因型之間的關系進行探討，為大白菜抗根腫病育種提供參考。