葉蓓，成宇，司玉瑩，陸柳，宗明，范列英

(同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院 檢驗(yàn)科，上海 200120)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis， RA)是一種慢性自身免疫性疾病，其病理機(jī)制主要是成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocyte，F(xiàn)LS)和巨噬細(xì)胞異常增多，導(dǎo)致滑膜組織增生、血管翳形成以及軟骨和軟骨下骨侵襲性破壞[1]。破骨細(xì)胞是引起骨侵蝕的主要細(xì)胞。多種促炎因子如巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)和核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)等均能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化[2-3]?？弓h(huán)瓜氨酸肽抗體是診斷RA的特異性血清標(biāo)志物，其分子靶點(diǎn)是瓜氨酸蛋白[4]。在Ca2+存在下，肽?；彼崦搧啺访?peptidyl arginine deiminase，PADI)可將肽基精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸，即蛋白質(zhì)瓜氨酸化。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，PADI4在RA患者外周血單核細(xì)胞和滑膜組織中顯著高表達(dá)，且能抑制FLS凋亡，促進(jìn)其增殖、活化，從而參與RA的發(fā)生與發(fā)展[5-6]。然而，PADI4在RA巨噬細(xì)胞中的作用及調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究擬通過分析低氧環(huán)境下巨噬細(xì)胞中PADI4的表達(dá)情況及其對破骨細(xì)胞分化和功能的影響，進(jìn)一步探討PADI4在RA發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細(xì)胞來源 小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞RAW264.7購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 方法

1.2.1 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7細(xì)胞用含10%FBS、1%青鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5% CO2、21%O2、37 ℃常氧培養(yǎng)和5% CO2、3%O2、37 ℃低氧培養(yǎng)。

1.2.2 體外誘導(dǎo)破骨細(xì)胞 將RAW264.7細(xì)胞以3×104個(gè)/孔的密度接種于24孔板，加入含有50 ng/mL M-CSF和50 ng/mL RANKL的完全DMEM高糖培養(yǎng)液孵育7 d，每3 d換液1次。

1.2.3 RAW264.7細(xì)胞中PADI4表達(dá)的抑制 在誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前將RAW264.7細(xì)胞接種于24孔板穩(wěn)定24 h。分別設(shè)立常氧-空白組、常氧-M-CSF+RANKL組、常氧-M-CSF+RANKL+Cl-amidine組、常氧-M-CSF+RANKL+siRNA組、低氧-空白組、低氧-M-CSF+RANKL組、低氧-M-CSF+RANKL+Cl-amidine組和低氧-M-CSF+RANKL+siRNA組。PADI4抑制劑Cl-amidine使用濃度為50 μmol/L。本課題組前期構(gòu)建好的PADI4-siRNA-MSN[7]使用量為30 μL/孔。每3 d換液1次，誘導(dǎo)7 d。

1.2.4 qRT-PCR檢測 按照qRT-PCR說明書配置20 μL反應(yīng)體系，使用PCR儀擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 °C變性30 s，95 °C 5 s，60 °C 34 s，二步法擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)。另外，溶解曲線分析：95 ℃15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，解離時(shí)間為4 s。采用2-ΔΔCt計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。

1.2.5 Western blotting檢測 各組誘導(dǎo)7 d后用RIPA裂解細(xì)胞，離心收集上清液，經(jīng)蛋白質(zhì)定量后，加入上樣緩沖液，100 ℃煮10 min后進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，之后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1.5 h，PBST洗膜，最后用ECL顯影。

1.2.6 TRAP染色 將RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)6 d后用PBS洗滌，加入1 mL 4%多聚甲醛37 ℃避光固定25 min，PBS洗滌3 次，加入TRAP染色液1 mL，37 ℃孵育45 min，超純水洗滌，在光鏡下進(jìn)行觀察。含3 個(gè)及3 個(gè)以上細(xì)胞核且呈TRAP染色陽性的酒紅色多核巨噬細(xì)胞為破骨細(xì)胞。

1.2.7 TRAP活性檢測 將RAW264.7細(xì)胞接種于12孔板，誘導(dǎo)6 d后裂解細(xì)胞，取上清液，經(jīng)蛋白質(zhì)定量后，按照抗TRAP檢測試劑盒說明書對TRAP活性進(jìn)行定量檢測。

1.2.8 體外骨吸收試驗(yàn) 將RAW264.7細(xì)胞以2×103個(gè)/孔的密度接種于置有牛骨片的96孔板，誘導(dǎo)7 d后進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色。用2.5%戊二醛固定液固定7 min，經(jīng)0.25 mol/L氫氧化銨超聲清洗后用梯度乙醇脫水，1%甲苯胺藍(lán)染液室溫染色3 min，蒸餾水洗滌。在光鏡下進(jìn)行觀察，隨機(jī)選取5個(gè)200倍視野計(jì)數(shù)，用Image Pro Plus軟件分析牛骨片上的骨吸收陷窩數(shù)及相對面積。

2 結(jié)果

2.1 低氧環(huán)境對破骨細(xì)胞形成的影響在常氧和低氧環(huán)境下M-CSF和RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，對細(xì)胞進(jìn)行TRAP染色并計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示，低氧-M-CSF+RANKL組TRAP陽性細(xì)胞數(shù)為(7.33±1.37)個(gè)/HP，常氧-M-CSF+RANKL組TRAP陽性細(xì)胞數(shù)為(3.33±1.63)個(gè)/HP，低氧環(huán)境中TRAP陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.01，圖1A、B)。低氧-M-CSF+RANKL組的TRAP活性顯著增加(P<0.001，圖1C)。

注：A.TRAP染色(×200)；B.TRAP陽性細(xì)胞量化；C.TRAP活性檢測。**P<0.01，***P<0.001。圖1 不同氧濃度下破骨細(xì)胞分化情況

2.2 低氧環(huán)境對骨吸收的影響將RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)7 d，用1%甲苯胺藍(lán)染色后計(jì)數(shù)骨吸收陷窩數(shù)量。結(jié)果顯示，破骨細(xì)胞在牛骨片上形成藍(lán)紫色橢圓形、圓形等多種形態(tài)，邊界較清楚，底部纖維紋路隱約可辨的骨陷窩(圖2)。低氧-M-CSF+RANKL組破骨細(xì)胞骨吸收陷窩數(shù)顯著多于常氧-M-CSF+RANKL組(P<0.05，表1)。

圖2 M-CSF和RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞后牛骨片的甲苯胺藍(lán)染色(×200)

表1 各組骨吸收陷窩數(shù)及相對面積的比較

2.3 低氧環(huán)境對TRAP和PADI4mRNA表達(dá)的影響用M-CSF和RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞7 d，分別在第3、5、7天抽提細(xì)胞中的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后用qRT-PCR檢測TRAP和PADI4 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，低氧-M-CSF+RANKL組TRAP和PADI4 mRNA相對表達(dá)水平較常氧-M-CSF+RANKL組顯著升高(P<0.05，圖3)。

注：*P<0.05，**P<0.01，****P<0.000 1。圖3 低氧環(huán)境對TRAP和PADI4 mRNA表達(dá)的影響

2.4 抑制巨噬細(xì)胞中PADI4的表達(dá)對TRAPmRNA及其蛋白表達(dá)的影響qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與低氧-M-CSF+RANKL組比較，低氧-M-CSF+RANKL+Cl-amidine組和低氧-M-CSF+RANKL+siRNA組的破骨細(xì)胞標(biāo)志物TRAPmRNA相對表達(dá)水平降低(P<0.05)。Western blotting結(jié)果顯示，與低氧-M-CSF+RANKL組比較，低氧-M-CSF+RANKL+Cl-amidine組和低氧-M-CSF+RANKL+siRNA組的TRAP蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。詳見圖4。

注：A、B.各組在常氧、低氧環(huán)境下PADI4 mRNA的量化；C、D.各組在常氧、低氧環(huán)境下TRAP mRNA的量化；E、F.Western blotting分別檢測PADI4 、TRAP蛋白的表達(dá)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1。圖4 抑制巨噬細(xì)胞中PADI4的表達(dá)對TRAP mRNA及其蛋白表達(dá)的影響

2.5 抑制巨噬細(xì)胞中PADI4的表達(dá)對破骨細(xì)胞分化的影響采用Cl-amidine和PADI4-siRNA抑制RAW264.7細(xì)胞中PADI4的表達(dá)。結(jié)果顯示，抑制RAW264.7細(xì)胞中PADI4的表達(dá)后，低氧-M-CSF+RANKL+Cl-amidine組和低氧-M-CSF+RANKL+siRNA組的TRAP陽性細(xì)胞數(shù)較低氧-M-CSF+RANKL組顯著減少(P<0.000 1，圖5A、B)。TRAP活性試驗(yàn)進(jìn)一步顯示，低氧-M-CSF+RANKL+Cl-amidine組和低氧-M-CSF+RANKL+siRNA組TRAP活性較低氧-M-CSF+RANKL組顯著降低(P<0.05，圖5C)。

注：A.TRAP染色(×100)；B.TRAP陽性細(xì)胞量化；C.TRAP活性檢測。*P<0.05，****P<0.000 1。圖5 抑制巨噬細(xì)胞中PADI4的表達(dá)對破骨細(xì)胞分化的影響

2.6 抑制巨噬細(xì)胞中PADI4的表達(dá)對骨吸收的影響抑制PADI4的表達(dá)后進(jìn)行1%甲苯胺藍(lán)染色。結(jié)果顯示，低氧-M-CSF+RANKL+Cl-amidine組和低氧-M-CSF+RANKL+siRNA組骨吸收陷窩數(shù)較低氧-M-CSF+RANKL組顯著減少(P<0.05)，低氧-M-CSF+RANKL+Cl-amidine組和低氧-M-CSF+RANKL+siRNA組骨吸收陷窩相對面積較低氧-M-CSF+RANKL組顯著降低(P<0.05，表2)。

表2 各組骨吸收陷窩數(shù)及相對面積的比較

3 討論

RA是一種常見的慢性自身免疫性疾病，其病理特點(diǎn)是持續(xù)的關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致骨代謝失衡，引起進(jìn)行性關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨破壞。超過60%的RA患者出現(xiàn)骨侵蝕，嚴(yán)重影響RA患者的預(yù)后[8]。目前，導(dǎo)致RA骨侵蝕的具體機(jī)制尚不清楚。眾多學(xué)者認(rèn)為，其可能與骨代謝失衡有關(guān)。RA滑膜組織中巨噬細(xì)胞和FLS異常增多，導(dǎo)致滑膜異常增厚和血管翳形成，從而進(jìn)一步活化血管翳旁破骨細(xì)胞，抑制成骨細(xì)胞的形成，導(dǎo)致骨代謝平衡被破壞[4-5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，RA-FLS的RANKL表達(dá)增加，而RANK-RANKL-骨保護(hù)素(osteoprotegerin, OPG)信號通路是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化成熟的主要信號通路。M-CSF和RANKL是誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的2個(gè)重要的細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化[3]。

RA患者滑膜處于2%～4% O2濃度的低氧環(huán)境[9]。低氧環(huán)境對破骨細(xì)胞的分化和成熟的影響仍然存在爭議。Muzylak等[10]研究發(fā)現(xiàn)，氧濃度是調(diào)節(jié)貓?bào)w內(nèi)破骨細(xì)胞形成的重要因子，低氧能促進(jìn)破骨細(xì)胞生成及破骨細(xì)胞骨吸收。Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，與正常雌性大鼠相比，低氧可以改變?nèi)ヂ殉驳拇菩源笫蠊俏h(huán)境，抑制成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)破骨細(xì)胞形成，從而減少骨形成，增加骨吸收，加速骨侵蝕。然而，Ma等[12]研究發(fā)現(xiàn)，低氧環(huán)境能通過調(diào)節(jié)JNK和IκBα的磷酸化抑制破骨細(xì)胞分化和骨吸收。Gorissen等[13]也發(fā)現(xiàn)，與常氧環(huán)境相比，在低氧環(huán)境下破骨形成減少。本研究為了更加符合RA患者的關(guān)節(jié)微環(huán)境，采用恒定低氧，且盡量減少常氧環(huán)境中更換培養(yǎng)液的時(shí)間。結(jié)果顯示，與常氧環(huán)境相比，低氧環(huán)境中破骨細(xì)胞的分化和骨吸收增加，說明低氧能夠促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，增強(qiáng)TRAP活性，促進(jìn)破骨細(xì)胞骨吸收。破骨細(xì)胞標(biāo)志基因TRAPmRNA的表達(dá)水平也與之相一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，低氧環(huán)境下PADI4 mRNA表達(dá)水平增加，且與破骨細(xì)胞標(biāo)志基因TRAPmRNA表達(dá)協(xié)同升高。PADI4是PADI的一個(gè)亞型，在Ca2+存在的情況下催化肽鏈上的精氨酸殘基轉(zhuǎn)化為瓜氨酸殘基。眾多研究發(fā)現(xiàn)，在RA外周血和滑膜組織高表達(dá)的PADI4參與了RA的發(fā)生和發(fā)展[14]。為了進(jìn)一步研究PADI4在調(diào)控巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化過程中是否起關(guān)鍵作用，本研究采用2種不同方法抑制細(xì)胞中PADI4的表達(dá)，包括PADI4抑制劑Cl-amidine和PADI4-siRNA-MSN。經(jīng)驗(yàn)證2種方法均成功抑制了RAW264.7細(xì)胞中PADI4的表達(dá)。研究結(jié)果顯示，低氧環(huán)境下抑制巨噬細(xì)胞PADI4的表達(dá)能夠顯著抑制巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化和破骨細(xì)胞骨吸收。然而，常氧環(huán)境下抑制PADI4的表達(dá)對誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化無明顯影響。因此推測，在低氧環(huán)境下巨噬細(xì)胞中高表達(dá)的PADI4可能參與了破骨細(xì)胞的分化和骨吸收。這與一些體內(nèi)試驗(yàn)的研究結(jié)果相一致。如抗PADI4抗體陽性患者的骨侵蝕程度顯著高于陰性患者[15]；在RA小鼠模型中抗瓜氨酸化抗體會加劇關(guān)節(jié)組織的損傷[16]。這些均可能與PADI4促進(jìn)破骨細(xì)胞形成相關(guān)。在后續(xù)的研究中本課題組將進(jìn)一步進(jìn)行探討。

綜上所述，本研究證實(shí)低氧環(huán)境可以顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化和骨吸收，PADI4可能在其中扮演著重要的角色，從而在RA關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞過程中起重要的作用。