高嶺，王莉，殷絲雨，劉麗莎

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 檢驗(yàn)科，南京 210008；2.皖南醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，蕪湖 241002)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種常見的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，主要病理改變?yōu)檠苎仔圆∽儯衫奂叭矶鄠€(gè)器官，其病因與發(fā)病機(jī)制尚不明確。SLE患者體內(nèi)可產(chǎn)生多種自身抗體，大量免疫復(fù)合物沉積是導(dǎo)致內(nèi)皮損傷和血管炎發(fā)生的主要原因[1]?？箖?nèi)皮細(xì)胞抗體(anti-endothelial cell antibody，AECA)是針對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞膜抗原而產(chǎn)生的一組抗體，可在多種血管炎性疾病患者的外周血中檢出，其在SLE病理損傷的作用日益引起人們重視[2]。本研究將對(duì)AECA在SLE患兒外周血中的表達(dá)情況及其臨床意義作一初步探討，以期尋求有利于SLE患兒疾病診斷及活動(dòng)性判斷的新標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象選取35例2018年6月—2019年10月在南京市兒童醫(yī)院風(fēng)濕免疫科住院部明確診斷為SLE的患兒為研究對(duì)象，其中活動(dòng)期患兒20例、緩解期15例?；純壕稀断到y(tǒng)性紅斑狼瘡診治指南(草案)》中對(duì)SLE的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，同時(shí)排除其他自身免疫性疾病及合并心、肺、腎、腦、造血系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病者，樣本采集前均未接受藥物治療。SLE疾病活動(dòng)性的判斷以SLE疾病活動(dòng)性評(píng)分(systemic lupus erythematosus disease activity index， SLEDAI)為標(biāo)準(zhǔn)，≥9分為疾病活動(dòng)，<9分為病情緩解。同時(shí)選取15例擇期手術(shù)兒童作為對(duì)照組，各組患兒性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。以上樣本的收集均獲得患兒家屬知情同意和醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 分別采集SLE患兒和對(duì)照組兒童靜脈血3 mL，采用常規(guī)方法分離血清，-70 ℃凍存待用。

1.2.2 血清AECA檢測(cè) 采用間接免疫熒光試劑盒(歐蒙醫(yī)學(xué)診斷有限公司)，以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)為底物，樣本1∶10稀釋后檢測(cè)血清中IgG型AECA。熒光顯微鏡下在細(xì)胞質(zhì)中可見綠色顆粒熒光判定為陽性，顆粒型熒光在靠近細(xì)胞核的位置上顆粒顯得更豐富。同時(shí)分別設(shè)置陰、陽性對(duì)照用于判斷實(shí)驗(yàn)的有效性。

1.2.3 血清dsDNA檢測(cè) 采用間接免疫熒光試劑盒(歐蒙醫(yī)學(xué)診斷有限公司)，樣本1∶10稀釋后檢測(cè)血清中dsDNA。同時(shí)分別設(shè)置陰、陽性對(duì)照用于判斷實(shí)驗(yàn)的有效性。

1.2.4 血清免疫球蛋白檢測(cè) 采用BNⅡ特種蛋白檢測(cè)分析儀(Siemens 公司)速率散射比濁法定量檢測(cè)患兒血清中IgA、IgM、IgG和C4的含量。

1.2.5 炎性因子檢測(cè) 用AccessⅡ化學(xué)發(fā)光儀定量檢測(cè)患兒血清中可溶性白細(xì)胞介素2受體(soluble interleukin 2 receptor，sIL-2R)、IL-6和TNF-α的含量。

1.2.6 尿微量蛋白檢測(cè) 采用尿微量蛋白分析儀檢測(cè)尿微量白蛋白(microalbuminuria，MA)、尿IgG(urine IgG，IGU)和尿α1微球蛋白(α1 microglobulin，A1M)的含量。

2 結(jié)果

2.1 各組患兒血清IgG-AECA陽性率的比較35例SLE患兒中IgG-AECA陽性18例，陽性率為51%，其中20例活動(dòng)期SLE組患兒中14例外周血IgG-AECA陽性，陽性率為70%，15例緩解期SLE組患兒中4例IgG-AECA陽性，陽性率為33%，15例對(duì)照組兒童外周血中IgG-AECA均為陰性。SLE組患兒以及活動(dòng)期SLE組患兒IgG-AECA陽性率與對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而緩解期SLE組與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 SLE組患兒外周血中dsDNA的檢測(cè)SLE患兒外周血中dsDNA陽性率為40%，活動(dòng)期時(shí)可高達(dá)55%，抗dsDNA和IgG-AECA聯(lián)合檢測(cè)時(shí)陽性率為69%，活動(dòng)期時(shí)可高達(dá)90%。SLE患兒特別是活動(dòng)期患兒使用抗dsDNA和IgG-AECA聯(lián)合檢測(cè)陽性率高于僅使用抗dsDNA檢測(cè)(P<0.05)，表明IgG-AECA在SLE疾病診斷，特別是活動(dòng)性判斷中具有一定的意義。詳見表1。

表1 SLE患兒外周血中dsDNA陽性率分析

2.3 IgG-AECA陽性組患兒和IgG-AECA陰性組患兒體液免疫相關(guān)指標(biāo)的比較IgG-AECA陽性組患兒外周血中IgA、IgM和IgG水平均高于IgG-AECA陰性組(P<0.05)，C4水平低于IgG-AECA陰性組(P<0.05，表2)。

表2 2組患兒體液免疫相關(guān)指標(biāo)差異分析

2.4 IgG-AECA陽性組患兒和IgG-AECA陰性組患兒炎性因子水平的比較分別觀察2組患兒外周血中常見炎性因子sIL-2R、IL-6和TNF-α的表達(dá)情況，可見IgG-AECA陽性組患兒外周血中炎性因子的表達(dá)顯著高于IgG-AECA陰性組(P<0.05，表3)。

表3 2組患兒炎性因子水平的比較

2.5 IgG-AECA陽性組患兒和IgG-AECA陰性組患兒纖維蛋白降解產(chǎn)物(fibrin degradation products，F(xiàn)DP)和D-二聚體水平的比較IgG-AECA陽性組患兒外周血中反映凝血系統(tǒng)中纖維蛋白溶解功能的指標(biāo)FDP和D-二聚體水平明顯高于IgG-AECA陰性組(P<0.05，表4)。

表4 兩組患兒外周血漿中FDP和D-二聚體水平的比較

2.6 IgG-AECA陽性組患兒和IgG-AECA陰性組患兒繼發(fā)狼瘡性腎炎 (lupus nephritis，LN)情況分析18例IgG-AECA陽性組患兒中繼發(fā)LN 10例，發(fā)病率為56%，17例IgG-AECA陰性組患兒中繼發(fā)LN 3例，發(fā)病率為18%，IgG-AECA陽性組SLE患兒LN患病率高于IgG-AECA陰性組(P<0.05)。

2.7 IgG-AECA診斷LN的ROC曲線分析IgG-AECA診斷LN的ROC曲線，結(jié)果顯示，IgG-AECA診斷LN的AUC為0.703(95%CI：0.522～0.883)，靈敏度和特異度分別為0.769和0.636(圖1)。

圖1 IgG-AECA診斷LN的ROC曲線

2.8 LN組患兒AECA陽性與否與其尿微量蛋白表達(dá)差異分析分別觀察繼發(fā)LN的患兒中IgG-AECA陽性組和IgG-AECA陰性組患兒MA、IGU和A1M的表達(dá)情況，可見IgG-AECA陽性組患兒上述3項(xiàng)指標(biāo)均高于IgG-AECA陰性組患兒(P<0.05)，表明IgG-AECA可加重患兒腎臟的損傷。詳見表5。

表5 LN組患兒AECA陽性與否與其尿微量蛋白表達(dá)差異分析

3 討論

SLE是一種原因不明的自身免疫性疾病，病變可累及多種系統(tǒng)、組織和器官。兒童SLE是指青春期前后的SLE，它的發(fā)病率在0.4/10萬～0.6/10萬，占所有SLE患者的15%～20%，且亞洲兒童的發(fā)病率高于全球水平。與成人相比，兒童SLE起病更急、病情更重、病程更為遷延，且常出現(xiàn)重要臟器損害，當(dāng)病變累及腎臟系統(tǒng)時(shí)稱為L(zhǎng)N。SLE在遺傳因素、環(huán)境因素、激素水平等多種因素共同作用下引發(fā)，但具體的發(fā)病機(jī)制尚不清楚[4]。作為自身免疫性疾病，SLE發(fā)病過程中伴隨著大量自身抗體的產(chǎn)生，抗原抗體復(fù)合物可沉積于各組織器官，引起組織器官病理性損傷?；颊唧w內(nèi)存在的多種自身抗體不僅僅作為疾病診斷的血清標(biāo)志物，也可作為致病因子參與疾病的發(fā)生、發(fā)展[5-6]。SLE早期癥狀不典型，易發(fā)生誤診， 如能對(duì)SLE患者進(jìn)行早期診斷和治療對(duì)改善患者預(yù)后具有積極作用。目前，臨床評(píng)估SLE常用的特異性體外診斷標(biāo)志物為抗Sm抗體，是 SLE 的標(biāo)志性抗體，特異度可達(dá)到99%，但靈敏度僅為25%，且出現(xiàn)后持續(xù)陽性，與疾病活動(dòng)性無關(guān)?？筪sDNA抗體作為判斷疾病活動(dòng)性的標(biāo)志物，靈敏度較差，易發(fā)生漏檢。因此，尋求新的可以預(yù)測(cè) SLE發(fā)生、進(jìn)展和惡化的生物標(biāo)志物有利于臨床更好地認(rèn)識(shí)疾病的發(fā)生、發(fā)展過程。AECA是一種針對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell，EC)表面靶抗原的異質(zhì)性抗體，可表達(dá)于多種以血管炎為主要特征的疾病患者外周血中。AECA造成EC損傷的具體機(jī)制可能為：AECA激活EC，上調(diào)炎性因子、細(xì)胞因子和黏附分子等表達(dá)，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞黏附于EC表面，繼而引起更多淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞與EC黏附，進(jìn)一步激活EC導(dǎo)致血管炎的發(fā)生[7-8]。AECA可在多種內(nèi)皮損傷性疾病患者外周血中檢出，如混合性結(jié)締組織病(mixed connective tissue disease， MCTD)[9]、肺動(dòng)脈高壓[10]、風(fēng)濕性心臟病[11]等。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)AECA與SLE的關(guān)系進(jìn)行了一些研究，發(fā)現(xiàn)在活動(dòng)期SLE患者外周血中亦可檢測(cè)出AECA，其靶抗原主要是鹽酸肝素、DNA或DNA-組蛋白，核糖體P蛋白、核糖體蛋白L6、延長(zhǎng)因子Ⅰa、線譜酸環(huán)化酶相關(guān)蛋白、纖溶酶原活抑制劑、纖維連接素等[12]，表明AECA作為免疫活性物質(zhì)參與SLE疾病發(fā)生、發(fā)展過程，即AECA與EC結(jié)合后通過一系列信號(hào)通路促進(jìn)炎性介質(zhì)的產(chǎn)生[13-15]。有研究表明，AECA在SLE以及LN的病理損傷中發(fā)揮了一定的作用，與疾病的活動(dòng)性相關(guān)[16-17]。韋薇等[18]的研究結(jié)果表明，SLE患者AECA陽性率為36%，但AECA陽性率在是否合并LN患者之間無顯著性差異；劉娜娜等[19]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AECA水平與LN疾病活動(dòng)程度相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，在SLE患兒體內(nèi)可檢測(cè)出IgG型AECA，且活動(dòng)SLE患兒陽性率明顯高于緩解期SLE患兒和擇期手術(shù)患兒。IgG-AECA陽性組患兒IgG、IgM、IgA水平明顯高于IgG-AECA陰性組患兒，C4水平明顯低于IgG-AECA陰性組患兒。此外，IgG-AECA陽性組患兒D-二聚體和FDP水平較IgG-AECA陰性組明顯升高，炎性因子、尿微量蛋白含量均高于IgG-AECA陰性組患兒。以上結(jié)果表明，SLE患兒體內(nèi)IgG-AECA與相應(yīng)抗原結(jié)合后激活補(bǔ)體系統(tǒng)，通過介導(dǎo)機(jī)體免疫功能紊亂、炎性介質(zhì)釋放、凝血纖溶系統(tǒng)活化等參與疾病的發(fā)展過程。此外，IgG-AECA與腎臟EC結(jié)合后可引起腎臟功能損傷，尿微量蛋白含量升高，在LN發(fā)生、發(fā)展中起著一定的致病作用。盡管本研究病例數(shù)量較少且只采用了間接免疫熒光法進(jìn)行檢測(cè)，所得結(jié)論也會(huì)與其它研究存在一定的差異，但現(xiàn)有結(jié)果為AECA在SLE患兒致病機(jī)制中作用的研究提供了研究依據(jù)，為進(jìn)一步開展深入研究奠定了基礎(chǔ)。綜上所述，IgG-AECA參與SLE的病理過程，對(duì)LN的診斷具有臨床指導(dǎo)意義。