蘭子君，郭靜宜，劉 軻,，孔金玉，高社干,

食管癌(esophageal cancer,EC)是全球發(fā)病率排名第七(3.2%)、死亡率排名第六(5.3%)的惡性腫瘤[1]。我國是全球食管癌發(fā)病及死亡的重災(zāi)區(qū)，國家癌癥中心最新數(shù)據(jù)顯示，2015年我國食管癌發(fā)病人數(shù)為24.6萬人，死亡人數(shù)則高達(dá)18.8萬人，其中約有90%為食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)[2]。由于患者早期癥狀不明顯，多數(shù)ESCC確診時已屬晚期，盡管近年來在診斷和治療方面取得了許多新的進(jìn)展，但預(yù)后仍不盡如人意，5 a生存率較低。手術(shù)切除結(jié)合新輔助化療是目前治療ESCC最常用的策略之一，而對化療的耐藥性仍是晚期ESCC患者治療失敗的主要原因[3]。因此，尋找ESCC早期篩查診斷、預(yù)后評估的新指標(biāo)，揭示ESCC的潛在耐藥機制，發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標(biāo)，對于ESCC的防控和診治至關(guān)重要。

腫瘤被認(rèn)為是“無法愈合的傷口”，腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅與惡性細(xì)胞本身有關(guān)，還取決于腫瘤的微環(huán)境(tumor micro-environment,TME)[4-7]。成纖維細(xì)胞是腫瘤基質(zhì)中分布最廣、最為豐富的細(xì)胞組分，活化的成纖維細(xì)胞被稱為腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblast,CAF)，是介導(dǎo)腫瘤與基質(zhì)間相互作用的最為重要的基質(zhì)細(xì)胞之一。大量證據(jù)表明，CAFs在腫瘤演變過程中扮演著重要角色[8-11]。近年來，CAF已成為腫瘤研究的熱點，并有希望成為新的預(yù)后標(biāo)志物和抗腫瘤治療靶標(biāo)。

本研究通過采用兩種不同的原代培養(yǎng)方法建立了ESCC相關(guān)CAFs細(xì)胞系，建立了成纖維細(xì)胞與食管癌KYSE150細(xì)胞細(xì)胞系的體外共培養(yǎng)模型，在此基礎(chǔ)上通過細(xì)胞功能學(xué)實驗對ESCC相關(guān)CAF的促癌作用進(jìn)行了初步的研究，為后續(xù)的理論和實驗研究奠定基礎(chǔ)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher，美國)；MACS組織處理器(Miltenyi Biotec，德國)；激光共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss AG，德國)；多功能酶標(biāo)儀(PerkinElmer，美國)；流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter，美國)。

選取2019年9月至2020年5月于河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院行食管癌根治術(shù)、病理確診為食管鱗癌的患者6例，經(jīng)患者簽署知情同意書，醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，取新鮮腫瘤組織及癌旁食管黏膜組織6例(取材距癌灶>5 cm)進(jìn)行原代培養(yǎng)。人食管癌細(xì)胞系KYSE150購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均購自美國Gibco公司；胰蛋白酶、青鏈霉素均購自北京索萊寶科技有限公司；MACS組織解離試劑盒購自德國Miltenyi Biotec公司；細(xì)胞增殖與活性檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)購自日本同仁化學(xué)研究所；流式凋亡檢測試劑盒購自美國Invitrogen公司；激光共聚焦培養(yǎng)皿、Transwell小室及細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)耗材均購自美國Corning公司；兔一抗波形蛋白(Vimentin)，細(xì)胞角蛋白(CK19)、α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)均購自英國Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)選擇人食管癌細(xì)胞系KYSE150，采用含10%FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；按1∶4比例傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2 組織塊貼壁法原代培養(yǎng)成纖維細(xì)胞術(shù)后30 min內(nèi)分別取直徑為1 cm的新鮮腫瘤組織及其對應(yīng)癌旁食管黏膜組織，生理鹽水洗凈后放入10×雙抗培養(yǎng)基，冰上運輸，10×雙抗4 ℃浸泡過夜。4×雙抗培養(yǎng)基浸洗3次，每次5 min，同時切除壞死部分。培養(yǎng)瓶預(yù)先以少量FBS浸潤，將組織剪成直徑0.1 cm、大小均勻的組織塊，以0.5 cm間距均勻鋪放于25 cm3培養(yǎng)瓶底部。倒置培養(yǎng)瓶，加入含4×雙抗，20%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，倒置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱，靜置12 h后翻轉(zhuǎn)。48 h后鏡下觀察，若有細(xì)胞爬出后，以含4×雙抗，20%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 組織解離法原代培養(yǎng)成纖維細(xì)胞術(shù)后30 min內(nèi)取直徑1 cm的新鮮ESCC腫瘤組織及其對應(yīng)癌旁食管黏膜組織，生理鹽水洗凈，放入10×雙抗培養(yǎng)基，4 ℃浸泡過夜。4×雙抗培養(yǎng)基浸洗3次，去除壞死部分，剪碎，使用MACS組織處理器以及MACS組織解離試劑盒對組織進(jìn)行解離。將細(xì)胞懸液加入含4×雙抗和20%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)。待細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合，采用連續(xù)貼壁法進(jìn)行純化傳代，純化3次后獲得成纖維細(xì)胞，并通過細(xì)胞免疫熒光法進(jìn)行鑒定。實驗用原代培養(yǎng)成纖維細(xì)胞傳代培養(yǎng)不得超過8代，以免其生物學(xué)功能發(fā)生改變影響實驗結(jié)果。

1.2.4 細(xì)胞免疫熒光制作細(xì)胞爬片，4%甲醛固定，0.2% TritonX-100透化，5%BSA封閉，一抗α-SMA(1∶500)，CK-19(1∶500)，Vimentin(1∶500)4 ℃孵育過夜，熒光二抗(1∶1 000，thermofisher)室溫孵育2 h，DAPI核染色，激光共聚焦顯微鏡觀察拍照，甘油封片，避光保存。

1.2.5 CCK-8繪制細(xì)胞生長曲線細(xì)胞消化重懸計數(shù)，接種于96孔板(每孔100 μL)，每孔3 000個，每組設(shè)置3個復(fù)孔，進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，根據(jù)實驗設(shè)置，在不同時間點終止培養(yǎng)，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，使用多功能酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光值，根據(jù)每個時間點的OD值繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.6 體外共培養(yǎng)模型與細(xì)胞功能實驗使用0.4 μm孔徑的Transwell小室將兩種細(xì)胞進(jìn)行間接共培養(yǎng)，按照1∶2的比例，將效應(yīng)細(xì)胞CAFs接種于Transwell小室中，靶細(xì)胞KYSE150接種于配套的細(xì)胞培養(yǎng)板中。細(xì)胞培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)后，將Transwell小室和培養(yǎng)板中培養(yǎng)基去除，培養(yǎng)板下室加入新的培養(yǎng)基，將Transwell小室放入細(xì)胞培養(yǎng)板中并加入新的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48～72 h后進(jìn)行后續(xù)實驗。用于劃痕實驗時，采用6孔板配套Transwell小室，直接在6孔板底部劃痕，PBS洗凈并換用無血清培養(yǎng)基，分別于0、8、16、24 h對同一位置進(jìn)行拍照，使用ImageJ軟件測量劃痕面積，統(tǒng)計傷口愈合百分比，分析細(xì)胞遷移能力差異。對于Transwell檢測腫瘤細(xì)胞侵襲能力的實驗，以1∶2的比例將ESCC細(xì)胞系接種于預(yù)鋪基質(zhì)膠的8.0 μm孔徑的Transwell小室中，CAFs接種于配套的24孔板中，建立共培養(yǎng)體系，24～48 h后用4%多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色，拍照計數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量，以評估不同分組ESCC的侵襲能力。

2 結(jié)果

2.1 兩種原代培養(yǎng)方法培養(yǎng)效果評估

分別采用組織解離法和組織塊貼壁法對6對ESCC患者腫瘤及其癌旁組織進(jìn)行原代培養(yǎng)，每日觀察，記錄細(xì)胞爬出時間、長滿培養(yǎng)瓶80%～90%時所需時間，并觀察細(xì)胞形態(tài)，評估培養(yǎng)效果。見表1。采用組織塊貼壁法培養(yǎng)，起初以上皮樣細(xì)胞為主，后期成纖維細(xì)胞優(yōu)勢生長，上皮樣細(xì)胞生長受到抑制，逐漸凋亡脫落；采用組織解離法培養(yǎng)，上皮樣細(xì)胞與成纖維細(xì)胞混雜生長，以成纖維細(xì)胞為主。見圖1。

表1 兩種原代培養(yǎng)方法效果評估

圖1 兩種方法培養(yǎng)細(xì)胞爬出與長滿狀態(tài)(40×)

2.2 成纖維細(xì)胞鏡下形態(tài)及生長曲線繪制

經(jīng)連續(xù)貼壁法對原代細(xì)胞進(jìn)行純化傳代3次，鏡下觀察兩種細(xì)胞，可見原代培養(yǎng)所得CAFs與PTFs均呈長梭形或星形，排列呈條索狀，呈放射狀或漩渦狀生長，符合成纖維細(xì)胞特點。相較PTFs而言，CAFs體積大小不一，突觸增多，排列無方向性，部分區(qū)域細(xì)胞重疊生長，接觸抑制與密度抑制消失。見圖2。

圖2 原代CAFs與PTFs鏡下形態(tài)

通過CCK8法檢測兩者增殖活性，在相同培養(yǎng)條件下將等量細(xì)胞(每孔3×103)接種于同一96孔板，每隔12 h進(jìn)行一次CCK-8孵育檢測，根據(jù)不同時間點OD 450 nm吸光值繪制細(xì)胞生長曲線。結(jié)果顯示，CAFs增殖速度較快，而PTFs生長緩慢，CAFs增殖能力明顯強于PTFs(P<0.05)。見圖3。

①P<0.01。

2.3 免疫熒光鑒定成纖維細(xì)胞

波形蛋白(Vimentin)是成纖維細(xì)胞特異性標(biāo)志物，而細(xì)胞角蛋白-19(CK-19)是鱗狀上皮細(xì)胞癌的特異性標(biāo)志物，兩者可用于鑒別成纖維細(xì)胞與上皮來源腫瘤細(xì)胞。通過免疫熒光法初步鑒定原代細(xì)胞中兩種標(biāo)志物的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，兩種細(xì)胞皆為Vimentin陽性，CK-19陰性，說明兩者均為成纖維細(xì)胞。α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)是成纖維細(xì)胞活化的典型標(biāo)志物，免疫熒光結(jié)果顯示，CAFs為α-SMA高表達(dá)細(xì)胞，PTFs為α-SMA弱表達(dá)細(xì)胞，證實本研究從ESCC腫瘤組織中分離出的成纖維細(xì)胞確為活化狀態(tài)的成纖維細(xì)胞，即癌相關(guān)成纖維細(xì)胞。見圖4。

圖4 免疫熒光鑒定CAFs與PTFs(100×)

2.4 CAFs促進(jìn)ESCC細(xì)胞系侵襲遷移

在共培養(yǎng)條件下，采用劃痕、Transwell 檢測兩種成纖維細(xì)胞對KYSE150細(xì)胞系遷移、侵襲等惡性生物學(xué)行為的影響。實驗分為對照組(150-BLANK)、CAF共培養(yǎng)組(150+CAF)與PTF共培養(yǎng)組(150+PTF)。結(jié)果顯示，兩種成纖維細(xì)胞對于KYSE150遷移行為均具有促進(jìn)作用，CAFs對于KYSE150遷移行為的促進(jìn)作用更為顯著(P<0.05)。見圖5。兩種成纖維細(xì)胞對于KYSE150侵襲能力均具有促進(jìn)作用，CAFs對于KYSE150侵襲能力的促進(jìn)作用更為顯著(P<0.05)。見圖6。由此可得，與PTFs相比，ESCC相關(guān)CAFs對于ESCC細(xì)胞遷移、侵襲行為具有顯著促進(jìn)作用。

①P<0.01；②P<0.001。

①P<0.01；②P<0.001。

3 討論

作為腫瘤基質(zhì)的主要組成部分，CAFs在腫瘤演變過程中扮演著重要角色[8]。CAF介導(dǎo)EMT、代謝重編程、癌癥干細(xì)胞(cancer stem cells,CSC)的誘導(dǎo)，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸、表觀遺傳學(xué)修飾、DNA損傷修復(fù)、自噬調(diào)節(jié)等，都與腫瘤進(jìn)展和耐藥機制密切相關(guān)[9-12]。但是，對CAF在ESCC中的作用的研究并不充分，并且促進(jìn)ESCC進(jìn)展的具體機制仍然未知。通過建立ESCC細(xì)胞系與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)體系，本研究發(fā)現(xiàn)ESCC相關(guān)CAFs可顯著促進(jìn)ESCC細(xì)胞的遷移、侵襲行為，這與多種其他類型腫瘤的研究結(jié)果相類似，而CAF促進(jìn)ESCC進(jìn)展的機制仍需進(jìn)一步研究。

永生化的成纖維細(xì)胞細(xì)胞系或經(jīng)10次以上傳代的原代培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，其生物學(xué)特性可能發(fā)生變化，不利于后續(xù)實驗進(jìn)行。所以，在CAF體外細(xì)胞功能學(xué)研究中，需要對CAF進(jìn)行原代培養(yǎng)并保證實驗用原代培養(yǎng)成纖維細(xì)胞為純化后的P3-P8代。本研究發(fā)現(xiàn)組織塊貼壁法原代培養(yǎng)成纖維細(xì)胞純度優(yōu)于組織解離法，但是程序復(fù)雜，對人員操作水平要求較高，成功率低。組織解離法原代培養(yǎng)操作簡便，培養(yǎng)成功率更高，細(xì)胞生長更快，但是試劑耗材成本較高。為了建立穩(wěn)定的成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)體系，本研究采用組織解離法，成功地從6例ESCC組織及其癌旁組織中分離出了6例CAFs與5例PTFs。此外，由于食管本身的開放性，組織極易被細(xì)菌、真菌污染，原代培養(yǎng)對于樣本的無菌要求極高，所以必須在離體30 min內(nèi)對組織進(jìn)行采樣洗滌，并及時浸泡在含10×雙抗的培養(yǎng)基中，冰上運輸，10×雙抗浸泡過夜，這些措施都是為了盡量減少組織污染的可能性，提高原代培養(yǎng)成功率。

本研究建立了穩(wěn)定的原代培養(yǎng)成纖維細(xì)胞體系，通過細(xì)胞共培養(yǎng)體系驗證了CAF對ESCC的促癌作用，為后續(xù)有關(guān)ESCC腫瘤微環(huán)境中CAF的理論和實驗研究奠定了基礎(chǔ)。