任 婧，王登奎，楊瑞娜，袁小志，劉志偉，王新帥

食管癌是全球第七大常見癌癥和第六大癌癥死亡原因[1]。食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)作為食管癌的主要亞型，在亞洲部分地區(qū)所有食管癌病例中占90%以上[2]。ESCC是一種惡性疾病，由于缺乏與診斷、治療及預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物，ESCC患者的總體預(yù)后差，5 a總生存率低至15%～25%[3]。因此，揭示ESCC發(fā)生和發(fā)展的分子機制,鑒定更敏感和特異的分子標(biāo)志物勢在必行，以期改善ESCC的早期診斷和預(yù)后。針對此現(xiàn)狀，本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫對ESCC和正常食管上皮組織的基因表達譜進行差異分析，發(fā)現(xiàn)KRT(Keratin,角蛋白)家族基因在ESCC的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中的作用，這將為 ESCC 患者提供潛在的生物標(biāo)志物。

1 材料方法

1.1 數(shù)據(jù)來源及處理食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)基因表達數(shù)據(jù)及臨床信息來自THE UCSC XENA (http://xena.ucsc.edu/)在線數(shù)據(jù)庫下載獲得的TCGA數(shù)據(jù)庫中的食管癌信息，包括82個ESCC組織和11個正常食管上皮組織。基于Rstudio軟件(4.0.4版本)將得到的樣本數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化、去除缺失值、探針與基因轉(zhuǎn)化等處理，將處理獲得的食管樣本表達數(shù)據(jù)進行后續(xù)分析。

1.2 差異基因鑒定基于R語言軟件包Limma包對ESCC和正常組織表達矩陣數(shù)據(jù)進行差異分析，以“FDR<0.05及|logFC|≥1”為差異基因篩選條件，得到顯著差異表達基因矩陣，并用ggplot2繪制可視化火山圖。

1.3 GO和KEGG富集分析DAVID是一個功能注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)庫。本研究使用DAVID(http://david-d.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫對顯著差異表達基因進行GO(gene ontology)和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)功能注釋，并通過R語言將富集分析結(jié)果可視化。GO包括生物學(xué)過程(biological process,BP)、細(xì)胞成分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵基因鑒定STRING (https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫用于評估基因之間的量化關(guān)系。Cytoscape軟件是一款強大的可視化和分析軟件,用于繪制蛋白-蛋白相互作用(protein protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)。采用Cytohubba中MCC拓?fù)浞治龇椒ǚ治龌蛑g的量化關(guān)系，基于Rank排序鑒定出關(guān)鍵基因。

1.5 關(guān)鍵基因生存預(yù)后及表達量分析為探究關(guān)鍵基因與ESCC患者生存預(yù)后的關(guān)系及其在ESCC患者中的表達量變化，本研究應(yīng)用在線數(shù)據(jù)庫THE KAPLAN-MEIER PLOTTRT(http://kmplot.com/analysis/index.php p=background)及UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/)數(shù)據(jù)庫分別進行生存預(yù)后分析和表達量驗證分析。

1.6 關(guān)鍵基因PPI網(wǎng)絡(luò)預(yù)測GENEMANIA(http://genemania.org/)是一個預(yù)測基因的蛋白相互作用和基因功能的數(shù)據(jù)庫[4]。該數(shù)據(jù)庫使用生物信息學(xué)方法顯示出基因的基因共表達、物理相互作用、基因共定位、基因富集分析，同時有位點預(yù)測的功能。本研究通過GENEMANIA預(yù)測了關(guān)鍵基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)，并可視化分析。

1.7 統(tǒng)計方法以P<0.05為有顯著統(tǒng)計學(xué)差異，本研究統(tǒng)計及分析采用R語言下Rstudio及相關(guān)軟件包。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)準(zhǔn)備及差異表達基因鑒定通過在線網(wǎng)站及R語言處理，將下載得到的93個樣本數(shù)據(jù)(82個ESCC組織及11個正常組織)進行標(biāo)準(zhǔn)化、探針與基因轉(zhuǎn)化等，得到19 560個基因表達矩陣，接著對基因表達矩陣進行差異分析，以“FDR<0.05及|logFC|≥1”為差異基因篩選條件，共得到708個顯著差異基因(335個上調(diào)差異基因和373個下調(diào)差異基因，圖1)，其中紅點代表上調(diào)差異基因，綠點代表下調(diào)差異基因。

圖1 差異表達基因火山圖

2.2 差異表達基因富集分析基于DAVID數(shù)據(jù)庫對708個顯著差異基因進行GO和KEGG富集分析。如圖2，GO富集分析揭示差異基因在生物學(xué)過程、細(xì)胞成分和分子功能方面主要參與蛋白酶解、角化細(xì)胞分化、角化作用、角蛋白絲、消化作用、質(zhì)膜組成部分、表皮結(jié)構(gòu)成分、絲氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑活化、絲氨酸肽鏈內(nèi)切酶活化等；KEGG富集分析顯示，差異基因主要與蛋白質(zhì)消化吸收、細(xì)胞色素P450相關(guān)生物代謝、神經(jīng)活性配體-受體的相互作用等通路相關(guān)。

圖2 差異表達基因富集分析

2.3 關(guān)鍵基因鑒定將708個顯著差異基因上傳至STRING數(shù)據(jù)庫得到基因之間的量化關(guān)系，并通過Cytoscape進行可視化分析，采用Cytoscape中的MCC算法獲得前30顯著差異基因網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)Rank=1的節(jié)點基因確定為關(guān)鍵基因(圖3)。本研究所確定的關(guān)鍵基因KRT9、KRT84、KRT82、KRT81、KRT79、KRT6B、KRT5、KRT3、KRT16等，均為KRT家族基因。

圖3 關(guān)鍵基因PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 關(guān)鍵基因預(yù)后及表達量分析將上文鑒定的關(guān)鍵基因通過KAPLAN-MEIER PLOTTER數(shù)據(jù)庫進行生存預(yù)后分析，發(fā)現(xiàn)KRT5、KRT6B、KRT16、KRT79基因高表達與ESCC患者預(yù)后差顯著相關(guān)(圖4)。本研究進一步通過UALCAN數(shù)據(jù)庫分析了KRT5、KRT6B、KRT16、KRT79基因在ESCC中的表達量分析，結(jié)果如圖5所示，對比食管腺癌和正常食管組織，KRT5、KRT6B、KRT16、KRT79基因在食管鱗癌中高表達。

圖4 KRT基因OS評估

圖5 KRT基因在食管鱗癌、食管腺癌和正常組織中差異表達

2.5 關(guān)鍵基因PPI網(wǎng)絡(luò)預(yù)測GENEMANIA數(shù)據(jù)庫預(yù)測的關(guān)鍵基因PPI網(wǎng)絡(luò)揭示出KRT5、KRT6B、KRT16、KRT79基因主要參與角質(zhì)化、皮膚發(fā)育、角化細(xì)胞分化和表皮細(xì)胞分化(圖6),支持KRT5、KRT6B、KRT16、KRT79的功能涉及角化細(xì)胞分化。

圖6 KRT基因PPI網(wǎng)絡(luò)預(yù)測

3 討論

ESCC是中國癌癥相關(guān)死亡的第四大原因[4]。ESCC的發(fā)生原因和潛在機制仍是一個世界性難題[5]。用于預(yù)測不同腫瘤的潛在生物標(biāo)志物的基因分析或微陣列技術(shù)是癌癥研究的新方式。本研究通過差異分析對比從TCGA數(shù)據(jù)庫獲得ESCC和正常食管組織基因表達譜，鑒定出708個顯著差異表達基因。發(fā)現(xiàn)差異基因主要參與角化細(xì)胞分化、角蛋白絲、表皮結(jié)構(gòu)成分等生物學(xué)通路，且差異基因中的KRT家族基因在調(diào)控ESCC中發(fā)揮著重要作用。生存預(yù)后結(jié)果提示KRT家族基因中KRT5、KRT6B、KRT16、KRT79(上調(diào)關(guān)鍵基因)高表達與ESCC患者預(yù)后差顯著相關(guān)，并通過對比食管正常組織及食管腺癌，再次證實KRT5、KRT6B、KRT16及KRT79在ESCC中起著上調(diào)作用。

KRT基因編碼一組不同的中間絲蛋白，其編碼蛋白構(gòu)成上皮細(xì)胞的細(xì)胞骨架，惡性腫瘤細(xì)胞常起源于這些上皮細(xì)胞[6-7]。既往研究報道KRT可能在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞生長、上皮極性、傷口愈合和組織重塑中發(fā)揮作用[8]。最新研究表明，KRT基因是上皮細(xì)胞中最常見和特異表達的基因，其在不同癌癥中的表達異常影響細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[9]。在尿路上皮細(xì)胞、乳腺和肺癌方面，KRT 經(jīng)常被用來確定癌細(xì)胞的起源，為診斷提供一定的指導(dǎo)[10]。KRT還參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)合成和極化細(xì)胞結(jié)構(gòu)的維持等[11]。

KRT5已被用作單獨的標(biāo)記物或與KRT6組合(KRT5/6)作為鱗癌抗原特異性免疫組化診斷的一部分[12-14]。膀胱癌中，KRT5/6 和 KRT20作為一種組合標(biāo)志物用于免疫組化分析，可幫助臨床評估患者化療受益情況[15]。SK-OV-3細(xì)胞中KRT5基因缺陷可阻止細(xì)胞遷移[16]。具有鱗狀分化小鼠的肌細(xì)胞中KRT5的表達與Trp53突變會導(dǎo)致浸潤性膀胱癌發(fā)生率更高[17]。肝癌細(xì)胞中，KRT6B過表達可促進癌細(xì)胞增殖并表現(xiàn)出抗凋亡作用，且KRT6B是Notch信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵介質(zhì)可能參與腎細(xì)胞癌的發(fā)生、進展和預(yù)后[18-19]。KRT6/16/17角蛋白的上調(diào)會改變角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、細(xì)胞黏附、遷移和炎癥特征，導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖和先天免疫激活以響應(yīng)表皮屏障破壞[20]。KRT16參與遺傳性皮膚病、銀屑病和癌癥相關(guān)的上皮炎癥發(fā)生，沉默KRT16通過抑制ERK信號通路來抑制銀屑病中角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和血管內(nèi)皮生長因子的分泌[21-22]。肺癌中KRT16過表達可促進腫瘤發(fā)生，并且 KRT16 表達可以作為獨立的預(yù)后標(biāo)志物[23]。 研究證實KRT79參與角化、發(fā)育生物學(xué)和啟動了毛管形態(tài)發(fā)生和再生[24]，其在癌癥中的生物學(xué)功能尚不清楚，進一步研究顯得尤為必要。

綜上所述，本研究通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫中的ESCC樣本，發(fā)現(xiàn)KRT家族在ESCC發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，且KRT5、KRT6B、KRT16及KRT79與ESCC預(yù)后顯著相關(guān)。由于KRT家族基因在ESCC中的研究較少，本研究可為ESCC研究提供一定的理論依據(jù)。