王杰，劉健，文建庭，王馨，忻凌，方妍妍，葛瑤

安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院風濕免疫科，合肥 230031

類風濕關節(jié)炎(RA)是一種常見的慢性自身免疫性疾病[1]，臨床主要出現(xiàn)關節(jié)滑膜炎癥等[2]，嚴重影響患者生活質量和社會功能[3-4]。RA歸屬于中醫(yī)學“痹證”范疇[5]，以濕熱痹阻證居多，主要臨床表現(xiàn)為關節(jié)腫痛而熱，屈伸不利；發(fā)熱、口渴、不欲飲、煩悶不安、小便黃；舌質紅，苔黃膩；脈滑數(shù)或弦滑等[6]。炎癥免疫反應是RA發(fā)病的主要病因[7]，患者感受(SPP)是評價RA結局的重要指標，RA炎癥免疫反應會導致SPP降低，嚴重影響患者生活質量。新風膠囊(Xinfeng caspule，XFC)與黃芩清熱除痹膠囊(Huangqin qingrechubi capsule，HQC)同為安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院院內制劑，臨床治療RA濕熱痹阻證常采用健脾清熱通絡法XFC聯(lián)合HQC，可以共同發(fā)揮清熱利濕、健脾通絡作用[8]。本文旨在通過關聯(lián)規(guī)則與動物實驗相結合，探究XFC聯(lián)合HQC如何改善RA濕熱痹阻證患者SPP及免疫炎癥反應，為臨床用藥提供參考。

1 資料與方法

1.1 病歷資料與方法

1.1.1 臨床資料 回顧性分析2019年2月至2020年12月在安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院風濕免疫科住院的208例RA濕熱痹阻證住院患者病歷資料，其中男性40例，女性168例；年齡(56.5±12.9)歲；病程(15.3±9.1)年。本研究通過安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審查(倫理編號：2019AH-12)。

1.1.2 診斷及納排標準

1.1.2.1 診斷標準 所有患者均符合2010年美國風濕病學會(ACR)聯(lián)合歐洲抗風濕病聯(lián)盟(EULAR)提出的RA診斷標準[9]；RA濕熱痹阻證中醫(yī)辨證論治方案參照2018年類風濕關節(jié)炎病證結合診療指南[10]。

1.1.2.2 納入標準 符合上述中西醫(yī)診斷；均簽署知情同意書；治療前后SPP量表、實驗室指標完善；住院期間均給予中醫(yī)藥治療：XFC(由黃芪、薏苡仁、蜈蚣、雷公藤組成)、HQC(由黃芩、梔子、薏苡仁、威靈仙等組成)：每粒含生藥0.4 g，專利號：ZL201310011369.8、ZL201110095718.X；再加中醫(yī)辨證論治[10]每日1劑，均以4周為1個療程。藥物由安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房和制劑室提供。

1.1.2.3 排除標準 關節(jié)嚴重畸形，完全喪失關節(jié)功能者；合并有心、肝、腎等嚴重疾病以及嚴重關節(jié)外表現(xiàn)；妊娠或哺乳期婦女；腫瘤性疾??；觀察期間應用免疫抑制劑和生物制劑的患者。

1.1.3 觀察指標

1.1.3.1 SPP量表 濕熱痹阻證候積分量表；脾虛濕盛證候積分量表；28個關節(jié)的疾病活動度(DAS28)評分；視覺模擬評分量表(VAS)；焦慮自評量表(SAS)、抑郁自評量表(SDS)；健康調查簡表(SF-36)。

1.1.3.2 實驗室指標 紅細胞沉降率(ESR)、C反應蛋白(CRP)、類風濕因子(RF)、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(CCP-AB)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、補體C3、補體C4。

1.1.4 關聯(lián)規(guī)則分析 治療前各指標、評分在正常值范圍內取值定為“0”，低于或高于正常值范圍取值定為“1”；治療后改善取值定為“1”，不變或加重定為“0”。設最小支持度為70%，最小置信度為80%，最小提升度為1，采用SPSS Clementine 12.0中的 Aprior 模塊挖掘中藥與SPP評分、實驗室指標間的關聯(lián)性[11]。

1.1.5 Spearman相關性分析 采用Spearman相關性分析分析RA濕熱痹阻證患者SPP與免疫炎癥指標之間關系。檢驗標準為P<0.05。

1.2 動物實驗與方法

1.2.1 實驗動物 30只雄性SD大鼠，購自安徽省實驗動物中心，喂養(yǎng)于保持室內環(huán)境安靜的動物房，維持溫度濕度穩(wěn)定。

1.2.2 藥品與試劑

1.2.2.1 藥品 XFC：黃芪476 g、薏仁米476 g、雷公藤238 g、蜈蚣24條；HQC：黃芩60 g、薏苡仁180 g、桃仁30 g、梔子54 g、威靈仙60 g；兩藥制作均為按比例加75%乙醇回流提取，藥渣再經水煎煮、濾過、靜置，取上清液同醇提液合并減壓濃縮收膏，最后加入糊精制成整粒；由安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑中心提供；弗氏完全佐劑(Sigma公司)。

1.2.2.2 試劑 戊巴比妥購自上海雅吉生物科技有限公司；CRP(SU-B30078)、RF(SU-B30575)、白細胞介素1β(IL-1β)(SU-B37304)、白細胞介素6(IL-6)(SU-B30201)、白細胞介素10(IL-10)(SU-B30217)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)(SU-B30274)購自泉州市睿信生物科技有限公司。

1.2.3 造模及給藥 將大鼠按照隨機數(shù)字表法分為正常組(NC)10只，模型組(MC)10只，XFC+HQC組10只；適應性飼養(yǎng)1周后。MC組與XFC+HQC組每只大鼠于右后足趾皮下注射弗氏完全佐劑0.1 mL，并放置于濕度90%，溫度：36～38 ℃，風速：5 m/s的氣候箱中，每日2次，每次2 h，連續(xù)14 d[12]。

造模后第15天進行給藥，NC組和MC組：0.9%氯化鈉(NaCl)，1 mL/100 g；XFC+HQC組：將XFC和HQC去除膠囊殼研磨成粉狀，加0.9%NaCl配成混懸液(每毫升含藥量0.068 g，1 mL/100 g灌胃30 d。

1.2.4 觀察指標 分別在大鼠造模前1天、給藥前1天、給藥后第30天，觀察各組大鼠的體質量(W)、足跖腫脹度(E)和關節(jié)炎指數(shù)(AI)。使用電子天平稱重大鼠W；按公式[13](給藥前腫脹度=Vt1-Vn1/Vn1×100%；給藥后腫脹度=Vt2-Vn2/Vn2×100%)測算大鼠E；按標準[14]測算大鼠AI：0分，無紅腫；1分，小趾關節(jié)紅腫；2分，趾關節(jié)和足跖腫脹；3分，踝關節(jié)以下足爪腫脹。收集大鼠腹主動脈血，以3 000 r/min轉速離心15 min提取血清，ELISA法測定大鼠血清炎癥和細胞因子表達量。

2 結果

2.1 RA濕熱痹阻證SPP及臨床指標變化 與治療前相比，RA濕熱痹阻證患者濕熱痹阻證候積分、脾虛濕盛證候積分、DAS28、VAS、SAS、SDS均顯著改善(P<0.05)，ESR、CRP、CCP-AB、RF、IgG均顯著下降(P<0.05)，IgA、IgM、C3、C4變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 RA濕熱痹阻證患者SPP及臨床指標的變化

2.2 RA濕熱痹阻證SPP與臨床指標相關性分析 Spearman相關性分析結果顯示，RA濕熱痹阻證患者DAS28評分與RF呈正相關(P<0.05)，濕熱痹阻證候積分與IgA、IgG、CCP-AB、脾虛濕盛證候積分呈正相關(P<0.05)；SAS評分與ESR、RF、C3呈正相關(P<0.05)，見圖1。

注：RF為類風濕因子，DAS28為28個關節(jié)的疾病活動度評分，IgA為免疫球蛋白A，IgG為免疫球蛋白G，CCP-AB為抗環(huán)瓜氨酸肽抗體，ESR為紅細胞沉降率，SAS為焦慮自評量表，C3為補體C3，RA為類風濕關節(jié)炎；SPP為患者感受。

2.3 XFC聯(lián)合HQC與SPP、實驗室指標改善的關聯(lián)規(guī)則分析 關聯(lián)規(guī)則結果顯示，XFC+HQC對SPP、實驗室指標改善的支持度均大于70%，置信度均大于80%，提升度均大于1，有較強關聯(lián)度，見表2。

表2 XFC聯(lián)合HQC治療與SPP、實驗室指標改善的關聯(lián)規(guī)則分析

2.4 XFC聯(lián)合HQC對AA濕熱痹阻證大鼠W、E和AI的影響 造模前，NC組、MC組、XFC+HQC組大鼠足趾腫脹程度無差異；造模后，大鼠足趾出現(xiàn)腫脹，膚色發(fā)紅緊繃并有熱感；XFC+HQC給藥后，大鼠足趾腫脹程度降低，膚色相對較白，局部皮溫恢復正常，見圖2。

圖2 各組大鼠足跖趾關節(jié)腫脹程度比較

與NC組相比，MC組大鼠W顯著下降，E和AI顯著升高(P<0.05)；經XFC聯(lián)合HQC治療后，大鼠W顯著升高，E和AI顯著下降(P<0.05)，見圖3。

2.5 XFC聯(lián)合HQC對AA濕熱痹阻證大鼠CRP、RF和細胞因子的影響 與NC組相比，AA濕熱痹阻證組RF、CRP、IL-1β、IL-6、TNF-α表達升高(P<0.05)，IL-10表達顯著下降；經XFC聯(lián)合HQC治療后，RF、CRP、IL-1β、IL-6、TNF-α表達顯著降低，IL-10表達顯著上升(P<0.05)，見圖4。

3 討論

RA以對稱性多關節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)，嚴重影響患者的生活質量[15]，SPP量表是評價包括RA在內的關節(jié)炎患者結局的重要標準。本團隊前期已研究表明，RA患者SPP與疾病活動性指標ESR、RF、CRP、IgG等密切相關，提示RA疾病活動度越高，SPP越差[16]。臨床上針對RA濕熱痹阻證常采用病證結合治療——新安健脾通痹系列方XFC聯(lián)合HQC。為了探究XFC聯(lián)合HQC對RA濕熱痹阻證SPP及免疫炎癥的干預作用，本研究對208例RA濕熱痹阻證患者進行回顧性分析，通過相關性分析研究SPP與臨床免疫炎癥指標之間的關系，關聯(lián)規(guī)則分析XFC聯(lián)合HQC與RA濕熱痹阻證SPP、炎癥指標改善的關聯(lián)度。此外，為了進一步從體內探究XFC聯(lián)合HQC對RA濕熱痹阻證SPP、免疫炎癥的影響，本研究建立AA濕熱證大鼠模型，并予以XFC聯(lián)合HQC灌胃，通過對W、E、AI變化觀察，類比RA患者SPP變化，并檢測AA濕熱證大鼠體內炎癥指標變化，從動物實驗角度補充說明健脾清熱通絡法XFC聯(lián)合HQC的療效。

孫玥等[16]通過選取604例RA患者及60例健康人對照分析發(fā)現(xiàn)RA患者普遍存在焦慮抑郁等情志障礙，且SDS、SAS與免疫炎癥指標存在顯著相關性。本研究發(fā)現(xiàn)RA濕熱痹阻證SPP與免疫炎癥指標也顯著升高，且SPP與免疫炎癥指標也呈顯著正相關；孫艷秋等[17]通過對1 251例RA患者數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)健脾化濕通絡法可有效調節(jié)RA患者免疫反應、抑制炎癥反應等，本研究關聯(lián)規(guī)則表明，XFC+HQC與SPP、實驗室指標的改善有顯著關聯(lián)；周丹丹等[18]通過XFC含藥血清干預AA大鼠發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，AA組大鼠IL-17、IL-21表達顯著升高，IL-10顯著降低，XFC組大鼠細胞因子IL-17、IL-21表達顯著降低，IL-10表達顯著升高，這與本研究結果相近，AA濕熱痹阻證大鼠W、IL-10顯著下降，E、AI、CRP、RF、IL-1β、IL-6、TNF-α顯著升高，經XFC+HQC干預后，各指標均有改善。

XFC具有健脾化濕通絡作用，方中黃芪、薏苡仁為君藥。其中黃芪甲苷可以通過調控JNK信號通路相關細胞因子表達抑制TNF-α誘導的RA滑膜成纖維細胞增殖[19]。動物實驗表明[20]薏苡仁蛋白和薏苡仁揮發(fā)油對AA大鼠具有顯著效果，可以減輕大鼠關節(jié)紅腫的癥狀，減輕E，降低大鼠血清中TNF-α、IL-1、IL-6的含量。有研究表明[21]XFC通過下調促炎因子，上調抑炎因子，改善患者免疫炎癥反應。HQC具有清熱除痹、健脾化濕功用，方中黃芩、梔子為君藥。研究表明[22]黃芩素可減輕RA患者外周血單個核細胞炎癥反應；實驗研究[23]梔子苷可升高IL-10表達，降低IL-17。研究發(fā)現(xiàn)[24]HQC明顯改善RA患者臨床癥狀和炎癥，其療效優(yōu)于來氟米特。數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)XFC聯(lián)合HQC能夠有效改善類風濕關節(jié)炎濕熱證患者的異常免疫炎癥指標[25]。

綜上所述，本研究通過RA濕熱痹阻證患者臨床數(shù)據(jù)分析結合AA濕熱證大鼠實驗，表明了XFC聯(lián)合HQC可以顯著改善患者SPP，提高生活質量，改善RA濕熱痹阻證患者免疫炎癥反應等，也可調控AA濕熱證大鼠的關節(jié)癥狀和炎癥水平。為XFC聯(lián)合HQC在臨床的應用上提供依據(jù)和指導作用，下一步本團隊將從生物分子學角度探究分析XFC聯(lián)合HQC對RA濕熱痹阻證患者的治療作用。

注：MC組與NC組比較，*P<0.05，** P<0.01；XFC+HQC組與MC組比較，#P<0.05， ##P<0.01。

注：RF為類風濕因子，CRP為C反應蛋白，IL-10為白細胞介素10，IL-1β為白細胞介素1β，IL-6為白細胞介素6，TNF-α為腫瘤壞死因子α；MC組與NC組比較，***P<0.001；XFC+HQC組與MC組比較， ##P<0.01，###P<0.001。