王英華，閆若潛，方先珍，班付國(guó)

(河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心/河南省重大動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)預(yù)警及防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450008)

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是豬的一種急性、高度接觸傳染性和高致死性傳染病，其病原是非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)[1]。自2018年8月非洲豬瘟在我國(guó)首發(fā)以來(lái)，我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)受到了重創(chuàng)。目前針對(duì)ASF，無(wú)藥可治，也未研制出能提供全面保護(hù)的疫苗[2]。ASFV的分子基礎(chǔ)及與機(jī)體組織細(xì)胞相互作用的機(jī)制仍不清楚。我們通過(guò)觀察多例非洲豬瘟病理組織學(xué)變化和免疫組織化學(xué)陽(yáng)性物質(zhì)沉著部位，結(jié)合Quintero等前人的報(bào)道和臨床特點(diǎn)，總結(jié)了非洲豬瘟病毒的細(xì)胞嗜性，為ASF疫苗研發(fā)、防治提供思路和方向。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源

采自河南省獲嘉縣發(fā)生非洲豬瘟疫情的養(yǎng)殖場(chǎng)。采集了4頭豬的脾臟、扁桃體、不同部位淋巴結(jié)(頜下淋巴結(jié)、腸淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)、腎淋巴結(jié))、心、肝、肺、腎和腸道等組織，每塊組織長(zhǎng)約2 cm，寬約1 cm，立即置于10%甲醛溶液中固定(以上操作在二級(jí)生物安全柜中進(jìn)行)。

1.2 試劑

一抗來(lái)自INGEZIM PPA COMPAC ASFV的單克隆抗體；免疫組化等試劑購(gòu)自武漢博士德生物有限公司。

1.3 方法

按常規(guī)石蠟切片制作技術(shù)制作連續(xù)切片，分別進(jìn)行蘇木素-伊紅染色和ASF免疫組織化學(xué)染色。蘇木素-伊紅染色按常規(guī)方法進(jìn)行，免疫組織化學(xué)染色方法按試劑操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。在顯微鏡下，ASF免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性反應(yīng)信號(hào)為棕紅色或棕黃色團(tuán)塊狀或顆粒狀。

1.4 樣品無(wú)害化處理

按《農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳關(guān)于做好非洲豬瘟實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作的通知》要求處理。

2 結(jié)果

2.1 ASF病理組織變化特點(diǎn)

2.1.1 脾臟

眼觀：重病例脾臟外觀呈黑紅色，外面有凝血塊，出血嚴(yán)重，腫脹，邊緣鈍圓；輕病例外觀顏色鮮紅，邊緣如紅刃卷起。顯微鏡下：脾臟是所有臟器出血最嚴(yán)重的臟器，大量出血，出血從周邊開(kāi)始，逐漸蔓延至白髓，最終吞噬白髓。淋巴細(xì)胞壞死，星空樣排空，可見(jiàn)細(xì)胞碎片。嗜酸性粒細(xì)胞增多。

圖1 脾臟：嚴(yán)重出血，出血從被膜下開(kāi)始，僅存?zhèn)€別脾小結(jié)，淋巴細(xì)胞壞死，形成細(xì)胞碎片，嗜酸性粒細(xì)胞增多

圖2 腸淋巴結(jié)、被膜下竇和小梁下竇的紅細(xì)胞量多于彌散淋巴組織，出血圍繞著淋巴小結(jié)。淋巴細(xì)胞壞死，小梁下竇內(nèi)小淋馬細(xì)胞增多，紅細(xì)胞圍繞著淋巴細(xì)胞形成花環(huán)。嗜酸性粒細(xì)胞增多。

2.1.2 腸淋巴結(jié)

眼觀：重癥外觀呈黑紅色，結(jié)構(gòu)肉眼不可見(jiàn)；輕癥切面呈大理石樣花紋。顯微鏡下：嚴(yán)重出血，出血從淋巴結(jié)邊緣開(kāi)始沿著彌散淋巴組織逐漸蔓延至淋巴小結(jié)。淋巴細(xì)胞壞死，淋巴小結(jié)呈星空樣排空，部分淋巴小結(jié)消失。被膜下竇、小梁下竇小淋巴細(xì)胞增多，核深染，紅細(xì)胞圍繞淋巴細(xì)胞形成花環(huán)。嗜酸性粒細(xì)胞增多。

圖3 腹股溝淋巴結(jié)，出血在被膜下、小梁下圍繞著淋巴小結(jié)出現(xiàn)。被膜下淋巴組織大片壞死。小梁下竇淋巴細(xì)胞增多，紅細(xì)胞圍繞著淋巴細(xì)胞形成花環(huán)。嗜酸性粒細(xì)胞增多。

2.1.3 腹股溝淋巴結(jié)

眼觀：外觀呈黑紅色，切面呈大理石樣花紋。顯微鏡下：嚴(yán)重出血，出血從淋巴結(jié)邊緣開(kāi)始沿著彌散淋巴組織逐漸蔓延至淋巴小結(jié)。淋巴細(xì)胞壞死，淋巴小結(jié)呈星空樣排空，部分淋巴小結(jié)消失。被膜下竇、小梁下竇小淋巴細(xì)胞增多，核深染，紅細(xì)胞圍繞淋巴細(xì)胞形成花環(huán)。嗜酸性粒細(xì)胞增多。

2.1.4 頜下淋巴結(jié)

眼觀：切面呈大理石樣花紋。顯微鏡下：出血從淋巴結(jié)邊緣開(kāi)始沿著彌散淋巴組織逐漸蔓延至淋巴小結(jié)。淋巴細(xì)胞壞死，淋巴小結(jié)呈星空樣排空，部分淋巴小結(jié)消失。被膜下竇、小梁下竇小淋巴細(xì)胞增多，核深染，紅細(xì)胞圍繞淋巴細(xì)胞形成花環(huán)。嗜酸性粒細(xì)胞增多。

圖4 頜下淋巴結(jié)，少量出血。淋巴細(xì)胞壞死，淋巴小結(jié)呈星空樣排空。

2.1.5 扁桃體

眼觀：無(wú)眼觀病變。顯微鏡下：重癥病例有輕微出血，出血包圍著淋巴小結(jié)。輕癥病例沒(méi)有出血。淋巴細(xì)胞壞死，有細(xì)胞碎片，淋巴小結(jié)呈星空樣排空。嗜酸性粒細(xì)胞增多。

2.1.6 肺臟

眼觀：深紅和淺紅交替，擠壓有白色泡沫流出。顯微鏡下：淤血、出血。肺間質(zhì)增寬，纖維素性肺炎，淋巴細(xì)胞增多。支氣管有異物、細(xì)胞碎片等。

圖6 肺臟：淤血，肺泡間質(zhì)增寬，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，嗜酸性粒細(xì)胞增多。細(xì)支氣管內(nèi)出現(xiàn)淋巴細(xì)胞和異物

2.1.7 肝臟

眼觀：重癥病例顏色深紅。輕癥無(wú)眼觀病變。顯微鏡下重癥病例：肝小葉間質(zhì)變寬，匯管區(qū)炎癥。每個(gè)肝小葉圍繞中央靜脈周?chē)胁∽?，中央靜脈周?chē)鲅课粺o(wú)可見(jiàn)肝細(xì)胞索；未出血部位，肝竇變寬，肝細(xì)胞索斷裂，每幾個(gè)肝細(xì)胞零散分布。肝竇內(nèi)有嗜酸性粒細(xì)胞。輕癥病例：肝小葉間質(zhì)增寬，淋巴細(xì)胞增多。肝細(xì)胞索間增寬。嗜酸性粒細(xì)胞增多。

圖7 肝臟：重癥病例出血，肝細(xì)胞空泡化，肝竇變寬，肝竇內(nèi)有紅細(xì)胞，吞噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。輕癥病例小葉間質(zhì)增寬，肝竇變寬。

2.1.8 腎臟

眼觀：有出血。顯微鏡下：少數(shù)腎小球出血，腎盂出血，髓質(zhì)淤血。腎小管內(nèi)皮細(xì)胞壞死或形成空泡。

2.1.9 心臟

眼觀：無(wú)肉眼可見(jiàn)病變。顯微鏡下：心肌基本正常，邊緣有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。由于采樣沒(méi)有采到心內(nèi)膜，所以未觀察到心內(nèi)膜的變化。

2.1.10 十二指腸

眼觀：無(wú)肉眼可見(jiàn)病變。顯微鏡下：重癥病例：淤血。腸絨毛上皮細(xì)胞空泡化、壞死、脫落，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。嗜酸性粒細(xì)胞增多。輕癥病例：淤血。腸道結(jié)構(gòu)基本正常，腺泡間嗜酸性粒細(xì)胞增多。

圖8 腎臟：腎小球出血，壞死。腎小管上皮細(xì)胞壞死，脫落，形成空泡。壞死部位出現(xiàn)透明變性。

圖9 心臟，心肌無(wú)肉眼可見(jiàn)病理變化，心臟貼近心包緣有出血和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖10 十二指腸，淤血，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，腸絨毛上皮細(xì)胞空泡化，嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，腸道可見(jiàn)脫落壞死細(xì)胞及分泌物。

2.2 ASF免疫組織化學(xué)結(jié)果

所有組織出血部位、淤血血管內(nèi)紅細(xì)胞均呈陽(yáng)性反應(yīng)，腸絨毛乳糜管內(nèi)有陽(yáng)性物質(zhì)團(tuán)塊，嗜酸性粒細(xì)胞呈陽(yáng)性反應(yīng)(見(jiàn)圖11)。

圖11 A.頜下淋巴結(jié)出血部位紅細(xì)胞呈陽(yáng)性反應(yīng)；B.腸絨毛中央乳糜管有棕黃色陽(yáng)性物質(zhì)團(tuán)塊；C.頜下淋巴結(jié)嗜酸性粒細(xì)胞內(nèi)有棕黃色陽(yáng)性物質(zhì)；D.腸道淤血部位呈陽(yáng)性反應(yīng)。

3 討論

3.1 ASF主要病理變化有：出血、壞死、嗜酸性粒細(xì)胞增多、淋巴細(xì)胞增多。脾臟是臟器出血最嚴(yán)重的器官。免疫器官病變嚴(yán)重程度依次為：脾臟>腹股溝淋巴結(jié)>腸淋巴結(jié)>頜下淋巴結(jié)>扁桃體；其它臟器病變嚴(yán)重程度：腸道>腎>肝>肺>心。肺臟毛細(xì)血管充滿(mǎn)炎性細(xì)胞，提示ASFV可能通過(guò)呼吸道感染。多組織出血、腎小管內(nèi)皮細(xì)胞嚴(yán)重受損以及肝、肺的病變提示，ASFV導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)皮系統(tǒng)損壞嚴(yán)重。

3.2 所有組織出血部位、淤血血管內(nèi)紅細(xì)胞ASF免疫組化染色均呈陽(yáng)性反應(yīng)，說(shuō)明ASFV易與紅細(xì)胞結(jié)合，這與1986年Quintero等的報(bào)道一致。實(shí)驗(yàn)室通過(guò)提取全血和其它組織樣品診斷非洲豬瘟?xí)r，全血的檢出率高于其它組織樣品。血清中出現(xiàn)的紅細(xì)胞吸附抑制抗體可以抑制ASFV在體外實(shí)驗(yàn)中的感染，并可以部分保護(hù)ASFV在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的感染[3]。推斷非洲豬瘟病毒對(duì)紅細(xì)胞具有親嗜性，非洲豬瘟病毒與紅細(xì)胞結(jié)合后，迅速破壞紅細(xì)胞，導(dǎo)致機(jī)體廣泛出血，這與臨床上感染非洲豬瘟病毒的豬幾小時(shí)內(nèi)就出現(xiàn)出血癥狀一致。由此推斷非洲豬瘟病毒的致病機(jī)制或?yàn)椋篈SFV通過(guò)呼吸道和消化道入侵豬體后，被機(jī)體扁桃體、頜下淋巴結(jié)或肺臟的巨噬細(xì)胞和機(jī)體內(nèi)皮細(xì)胞吞噬，介導(dǎo)ASFV接觸紅細(xì)胞并結(jié)合，破壞紅細(xì)胞系統(tǒng)，導(dǎo)致機(jī)體大量、廣泛出血。

3.3 嗜酸性粒細(xì)胞增多是ASF的一個(gè)顯著病理變化，并且ASF免疫組化結(jié)果顯示嗜酸性粒細(xì)胞內(nèi)有陽(yáng)性顆粒，提示嗜酸性粒細(xì)胞可能吞噬了ASFV，逃避宿主的免疫系統(tǒng)[4]。腸絨毛乳糜管內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色ASFV陽(yáng)性物質(zhì)，提示ASFV有通過(guò)腸道入侵機(jī)體的可能。