李佳昕，鄭嘉欣，陳中元，王貴平

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128; 2.常德市農(nóng)業(yè)大分子研究中心，湖南 常德 415006; 3.湖南文理學(xué)院 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 常德 415006)

1 前言

隨著我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展以及重大動(dòng)物疫病對(duì)養(yǎng)殖業(yè)、公共安全衛(wèi)生、人體健康的危害程度不斷增大，重大動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)的重要性越來(lái)越明顯，免疫動(dòng)物血清抗體效價(jià)檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用也更加廣泛，作用日益突出[1,2]。目前，使用ELISA方法對(duì)動(dòng)物抗體進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估免疫水平是豬場(chǎng)主要的疫病監(jiān)測(cè)方式，但散養(yǎng)戶和中小型規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)通常不具備檢測(cè)條件，經(jīng)常需要借助第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)來(lái)進(jìn)行評(píng)估。然而養(yǎng)殖場(chǎng)通常地處偏僻，距離檢測(cè)機(jī)構(gòu)路途遙遠(yuǎn)，運(yùn)送時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，這就需要適合的樣品運(yùn)輸方式[3,4]。血清抗體是一種蛋白質(zhì)，其質(zhì)量控制對(duì)檢測(cè)有著非常重要的影響，只有嚴(yán)格做好樣品的質(zhì)量控制，才能確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。尤其在運(yùn)輸中，較高的環(huán)境溫度和較長(zhǎng)運(yùn)輸時(shí)間等因素都可能使抗體的品質(zhì)發(fā)生變化，影響血樣質(zhì)量。因此，樣品運(yùn)輸是一項(xiàng)復(fù)雜、具有挑戰(zhàn)性和經(jīng)常被忽視的任務(wù)。目前常用的血清樣品運(yùn)輸方法為泡沫盒加冰袋，這一方法雖然方便快捷，但保溫效果受外界溫度影響大，且有一定的時(shí)限性，可能會(huì)對(duì)樣品檢測(cè)結(jié)果造成一定影響[5,6]。為了確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，探究運(yùn)輸過(guò)程中泡沫箱的保溫效果及箱內(nèi)溫度變化對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響尤為重要。

本試驗(yàn)?zāi)M血清樣品在不同外界運(yùn)輸溫度下采用傳統(tǒng)泡沫盒加冰袋運(yùn)輸方式，探究泡沫箱內(nèi)的溫度變化以及時(shí)長(zhǎng)對(duì)口蹄疫O型抗體效價(jià)的影響，以期為有效運(yùn)輸畜禽血清樣品給出合理建議。

2 材料

2.1 試劑與儀器

口蹄疫O型病毒單抗競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自內(nèi)蒙古金邁詩(shī)生物科技有限公司(生產(chǎn)批號(hào)：20200424)；冰袋購(gòu)自廈門齊冰冷鏈科技公司；酶標(biāo)儀為瑞士Tecan Infinite F50型。

2.2 血液樣品

10份口蹄疫O型抗體血清采自湖南省婁底市某豬場(chǎng)(30天前已免疫口蹄疫O型滅活疫苗)。

3 方法

3.1 泡沫箱設(shè)置

在3個(gè)大小規(guī)格相同的泡沫箱(內(nèi)尺寸28*18*22 cm；外尺寸33*23*28 cm)內(nèi)放入5個(gè)冰袋(300 g)，分別置于37 ℃恒溫箱、25 ℃恒溫箱和4 ℃冰箱中。將溫度計(jì)插入泡沫箱內(nèi)，定期觀察箱中溫度的變化。

3.2 血清抗體檢測(cè)

將10份口蹄疫O型抗體陽(yáng)性血清，每份分裝為3份，分別放入3個(gè)內(nèi)含冰袋的泡沫箱中。在0 h、24 h、36 h、48 h、60 h不同時(shí)長(zhǎng)分別取出少量血清，按口蹄疫ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)上步驟進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)操作前，首先將試劑盒中洗滌緩沖液組分用去離子水進(jìn)行20倍稀釋，在包被板上設(shè)置陰性對(duì)照孔、陽(yáng)性對(duì)照孔和待檢樣品孔，并將待檢血清用稀釋后的洗滌緩沖液進(jìn)行20倍稀釋(陰陽(yáng)性對(duì)照不稀釋)，每孔加入50 μL。之后立即在所有孔中加入50 μL酶標(biāo)二抗，充分混勻，37 ℃孵育30 min后，棄掉孔中液體，使用稀釋后洗滌緩沖液洗滌3～5次。最后將等體積底物A與底物B溶液混勻，每孔加入50 μL混合液，37 ℃孵育30 min后，每孔再加入50 μL終止液終止反應(yīng)，立即在酶標(biāo)儀上讀取450 nm的吸光值(OD450值)。

3.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)說(shuō)明書(shū)中公式S/N=(ODNC-ODsample)/(ODN-ODPC)計(jì)算出血清口蹄疫抗體的S/N值，其中NC為陰性對(duì)照孔OD450 nm吸光值，PC為陽(yáng)性對(duì)照孔OD450 nm吸光值。當(dāng)S/N值<0.4時(shí)，樣品為口蹄疫O型抗體陰性；當(dāng)S/N值≥0.4時(shí)，樣品為口蹄疫O型抗體陽(yáng)性。

4 結(jié)果

4.1 不同環(huán)境溫度下泡沫箱內(nèi)的溫度變化

4.1.1 環(huán)境溫度為4 ℃時(shí)泡沫箱內(nèi)的溫度變化

環(huán)境溫度為4 ℃時(shí)泡沫箱內(nèi)的溫度變化如表1所示，泡沫箱內(nèi)的溫度在2 h時(shí)下降至最低溫度(1 ℃)，并能維持6 h后再緩慢上升。泡沫箱內(nèi)的溫度在60 h內(nèi)可以保持在3 ℃以下。

表1 環(huán)境溫度為4 ℃時(shí)泡沫箱內(nèi)的溫度變化

4.1.2 環(huán)境溫度為25 ℃時(shí)泡沫箱內(nèi)的溫度變化

環(huán)境溫度為25 ℃時(shí)泡沫箱內(nèi)的溫度變化如表2所示，泡沫箱內(nèi)的溫度在4 h時(shí)下降至最低溫度(7.5 ℃)，并維持2 h后緩慢上升。泡沫箱內(nèi)的溫度在12 h之內(nèi)可以保持在10 ℃以下。

表2 環(huán)境溫度為25 ℃時(shí)泡沫箱內(nèi)的溫度變化

4.1.3 環(huán)境溫度為37 ℃時(shí)泡沫箱內(nèi)的溫度變化

環(huán)境溫度為37 ℃時(shí)泡沫箱內(nèi)的溫度變化如表3所示，泡沫箱內(nèi)的溫度在4 h時(shí)下降至最低溫度(12.5 ℃)之后立即上升，泡沫箱內(nèi)的溫度在12 h之內(nèi)可以保持在15 ℃以下。

表3 環(huán)境溫度為37 ℃時(shí)泡沫箱內(nèi)的溫度變化

4.2 不同環(huán)境溫度下運(yùn)輸時(shí)長(zhǎng)對(duì)抗體檢測(cè)結(jié)果的影響

4.2.1 環(huán)境溫度為4 ℃時(shí)泡沫箱內(nèi)血清抗體變化

環(huán)境溫度為在4 ℃時(shí)泡沫箱內(nèi)血清的抗體水平呈下降趨勢(shì) (表4)，初始時(shí)的血清抗體S/N平均值為0.858，在24 h時(shí)下降為0.851，僅有0.007的下降幅度，仍保持在0.85以上。而在36 h時(shí)，抗體S/N平均值已下降至0.8以下。

4.2.2 環(huán)境溫度為25 ℃時(shí)泡沫箱內(nèi)血清抗體的變化

環(huán)境溫度為25 ℃時(shí)泡沫箱內(nèi)血清的抗體水平呈下降趨勢(shì)(表5)，初始時(shí)的血清抗體S/N平均值為0.858，在24 h時(shí)下降至0.834，在36 h下降至0.809，仍保持在0.8以上。

表4 環(huán)境溫度為4 ℃時(shí)泡沫箱內(nèi)血樣S/N值變化

表5 環(huán)境溫度為25 ℃時(shí)泡沫箱內(nèi)血樣S/N值變化

4.2.3 環(huán)境溫度為37 ℃時(shí)泡沫箱內(nèi)血清抗體的變化

環(huán)境溫度為37 ℃時(shí)泡沫箱內(nèi)血清的抗體水平呈下降趨勢(shì)(表6)。初始0 h時(shí)的血清抗體S/N平均值為0.858，在24 h時(shí)下降至0.809，在36 h時(shí)降至0.762。

表6 環(huán)境溫度為37 ℃時(shí)泡沫箱內(nèi)血樣S/N值變化

5 討論

在當(dāng)前非洲豬瘟嚴(yán)峻疫情的大環(huán)境下，對(duì)豬群的抗體水平監(jiān)測(cè)愈加重要。只有對(duì)豬群抗體水平進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)估，才能真正對(duì)豬群免疫動(dòng)態(tài)進(jìn)行監(jiān)控。沒(méi)有自建免疫檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的中小規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)和散養(yǎng)戶經(jīng)常使用泡沫箱加冰袋的運(yùn)輸方式，將血樣送至檢測(cè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行抗體檢測(cè)[7,8]。但通常血液樣品對(duì)運(yùn)輸條件有十分嚴(yán)格的要求，溫度、運(yùn)輸時(shí)間等都會(huì)對(duì)血樣質(zhì)量造成影響[9，10]。本試驗(yàn)對(duì)泡沫箱加冰袋這一方式運(yùn)輸時(shí)箱內(nèi)的溫度變化進(jìn)行了探究，采用的方法是對(duì)全年不同氣候下的環(huán)境進(jìn)行了模擬，如4 ℃冰箱、25 ℃溫箱和37 ℃溫箱分別對(duì)應(yīng)了寒冷的冬春季、涼爽的秋季以及炎熱的夏季，結(jié)果發(fā)現(xiàn)泡沫箱內(nèi)的溫度變化趨勢(shì)與外界溫度呈正相關(guān)，外界環(huán)境溫度越高，泡沫箱內(nèi)溫度上升越快。此外，本實(shí)驗(yàn)還對(duì)溫度變化對(duì)抗體檢測(cè)結(jié)果的影響進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)在不同外界環(huán)境下模擬運(yùn)輸，泡沫箱內(nèi)血清樣品的抗體水平總體呈下降趨勢(shì)。10份血樣初始(0 h)的口蹄疫O型抗體S/N平均值為0.858，4 ℃下泡沫箱內(nèi)放置24 h后仍保持在0.85以上，獲得的檢測(cè)結(jié)果最接近初始值；血清在25 ℃和37 ℃時(shí)泡沫箱內(nèi)放置24 h后的抗體值也都可以保持在0.8以上。但在60 h時(shí)，三種環(huán)境溫度下的血樣抗體S/N值全部下降至0.8以下。其中在37 ℃環(huán)境下運(yùn)輸36 h時(shí)就已下降至0.762。這可能是由于在37 ℃環(huán)境運(yùn)輸36 h時(shí)，泡沫箱內(nèi)溫度就已達(dá)到27 ℃，且長(zhǎng)時(shí)間的高溫運(yùn)輸條件可能會(huì)對(duì)血清中抗體的品質(zhì)造成影響，進(jìn)而影響抗體檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[11]。不同時(shí)長(zhǎng)的檢測(cè)結(jié)果充分證明：全年豬場(chǎng)采血后在24 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)結(jié)果的影響最小，獲得的結(jié)果比較準(zhǔn)確。