姬向波，皇甫和平，張曉曼，唐桂芬，向瑞平

(1.河南省非常規(guī)飼料資源創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046)

鴨源雞桿菌(Gallibacteriumanatis，G.anatis)是巴氏桿菌科雞桿菌屬的代表種，是家禽上呼吸道的一種常在菌。該菌的感染可致蛋雞發(fā)生腹膜炎和輸卵管炎，并常和大腸桿菌等條件性致病菌引發(fā)混合感染，引起蛋雞產(chǎn)蛋量下降、死亡率升高。該菌具有多重耐藥性，臨床用藥效果不佳，嚴(yán)重影響蛋雞養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益[1，2]。

5′-甲硫腺苷/S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(5′-Methylthioadenosine/S-adenosylhomocysteinen ucleosidase，PFS)是細(xì)菌的甲硫氨酸循環(huán)過(guò)程中調(diào)節(jié)平衡的關(guān)鍵酶，其參與的甲硫氨酸循環(huán)可產(chǎn)生密度感應(yīng)信號(hào)分子AI-2[3，4]。體外原核表達(dá)的禽致病性大腸桿菌、鴨疫里默氏桿菌的PFS蛋白和LuxS蛋白，具有共同催化S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosyl homocysteine，SAH)產(chǎn)生信號(hào)分子AI-2的生物活性[5，6]。金黃色葡萄球菌的pfs基因可能通過(guò)降低自溶分泌的胞外DNA水平從而降低生物膜的形成能力和體內(nèi)增殖能力，導(dǎo)致胞外蛋白酶水平下調(diào)、菌株毒力下降[7]，因此pfs可作為治療金黃色葡萄球菌藥物的靶點(diǎn)，為研發(fā)治療多重耐藥菌的藥物提供新思路。

皇甫和平等[8]從河南地區(qū)發(fā)生輸卵管炎和腹膜炎為主要特征的母雞體內(nèi)分離到多株鴨源雞桿菌，經(jīng)鑒定均具有多重耐藥性，但目前尚不清楚這些菌株是否攜帶和表達(dá)pfs基因。本試驗(yàn)以具有多重耐藥性的臨床分離株G7的基因組為模板，擴(kuò)增了pfs基因，并與其他參考菌株相應(yīng)的基因序列和氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)載體，初步摸索了誘導(dǎo)表達(dá)條件，為G7菌株相應(yīng)基因功能的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

致母雞輸卵管炎的鴨源雞桿菌分離株G7和質(zhì)粒pET-30a由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院獸醫(yī)臨床實(shí)驗(yàn)室保存。凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、Taq DNA酶購(gòu)自TIAN GEN公司。限制性?xún)?nèi)切酶XhoI、NdeI和T4DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 鴨源雞桿菌分離株G7基因組的DNA提取參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.2pfs基因的克隆及序列分析 參考G.anatisUMN179(GeneID:CP002667.1)的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物：

上游pfs(Nde I)-F：5′-GGAATTCCATATGACAAGAACAACGAGGAA-3′

下游pfs(Xho I) -R：5′-CCGCTCGAGTGACACCAACTTTTCCAA-3′

引物由上海生工公司合成。

按照郭秉嬌等[9]的PCR程序擴(kuò)增目的片段。PCR產(chǎn)物回收后，送上海生工公司測(cè)序。利用MegAlin軟件，將獲得序列與參考株鴨源雞桿菌(GeneID:CP002667.1、NZ_JTJO01000024、JPHN01000016)、巴斯德桿菌(GeneID:NZ_CP028962.1)、大腸桿菌(GeneID:NC_000913.3)、沙門(mén)桿菌(GeneID:NC_003197.2)的pfs基因序列進(jìn)行比對(duì)。

1.2.3 pET-30a-pfs原核表達(dá)載體的構(gòu)建 將測(cè)序驗(yàn)證正確的pfs基因PCR擴(kuò)增膠回收產(chǎn)物用XhoI和NdeI雙酶切，與pET-30a質(zhì)粒的XhoI、NdeI雙酶切膠回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，CaCl2法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 重組PFS蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE分析 將構(gòu)建好的原核表達(dá)載體pET-30a-pfs轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞，22 ℃ IPTG誘導(dǎo)4 h后，每間隔2 h收集一次菌液，直至22 h。將收集的菌液離心收獲菌體，超聲裂解后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

2 結(jié)果與分析

2.1 pfs基因的克隆與序列分析

PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1，擴(kuò)增條帶大小約700 bp，與參考株的pfs基因的大小一致，經(jīng)測(cè)序獲知鴨源雞桿菌G7的pfs基因全長(zhǎng)為693 bp，編碼231個(gè)氨基酸。pfs基因的核苷酸同源性比對(duì)結(jié)果(圖2)顯示，鴨源雞桿菌G7與鴨源雞桿菌(NZ_JTJO01000024)和鴨源雞桿菌(JPHN01000016)的同源性為97.1%，與大腸桿菌(NC_000913.3)和沙門(mén)桿菌(NC_003197.2)的同源性為58.2%。pfs基因編碼的氨基酸序列的同源性比對(duì)結(jié)果(圖3)顯示，鴨源雞桿菌G7與3個(gè)鴨源雞桿菌參考株的同源性均在94%以上，與多殺性巴斯德桿菌(NZ_CP028962.1)的同源性為60.4%，與大腸桿菌(NC_000913.3)和沙門(mén)菌(NC_003197.2)的同源性均在60%以下。

2.2 pET-30a-pfs原核表達(dá)載體的鑒定

用限制性?xún)?nèi)切酶NdeI、XhoI對(duì)pET-30a(+)-pfs質(zhì)粒雙酶切，結(jié)果有兩個(gè)條帶(圖4)，分別約為5400 bp和700 bp，表明pET-30a(+)-pfs質(zhì)粒重組成功。

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE鑒定

含有重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)-pfs的BL21在不同時(shí)間的表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)SDS-PAGE電泳，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，表達(dá)的重組蛋白大小與預(yù)期結(jié)果一致，約28 kD，且表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加。

圖1 鴨源雞桿菌G7株pfs基因的擴(kuò)增M：DL2000；1、2: pfs擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 分離株與參考菌株pfs基因核苷酸同源性比對(duì)

圖3 分離株與參考菌株pfs基因編碼氨基酸序列同源性比對(duì)

圖4 pET-30a-pfs的雙酶切鑒定M：DL5000；1、2、3：pET-30a-pfs的雙酶切產(chǎn)物

圖5 原核表達(dá)PFS蛋白的SDS-PAGE結(jié)果M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1-9：不同誘導(dǎo)時(shí)間的表達(dá)產(chǎn)物；10：pET-30a對(duì)照

3 討論

鴨源雞桿菌作為危害養(yǎng)雞業(yè)的條件性致病菌，其血清型復(fù)雜，在目前公認(rèn)的24種血清型中，有3種致病性血清型，分別為1型、2型和4型。不同血清型之間缺少交叉免疫保護(hù)作用，而且隨著臨床分離株的增多，雞桿菌的血清型有可能會(huì)增加。鴨源雞桿菌的多重耐藥性極為普遍，對(duì)鴨源雞桿菌多重耐藥性機(jī)制及其防控藥物的研究十分迫切。本試驗(yàn)研究了鴨源雞桿菌的pfs基因，旨在發(fā)現(xiàn)其與鴨源雞桿菌的致病性和耐藥性是否存在相關(guān)，為鴨源雞桿菌致病機(jī)制的研究和藥物治療靶點(diǎn)的選擇提供依據(jù)。

本試驗(yàn)對(duì)鴨源雞桿菌的pfs基因進(jìn)行克隆和原核表達(dá)。核苷酸同源性分析結(jié)果顯示，臨床分離的鴨源雞桿菌G7的pfs基因與3個(gè)鴨源雞桿菌參考株(GeneID:CP002667.1、NZ_JTJO01000024、JPHN01000016)pfs基因的核苷酸序列同源性高達(dá)90%以上，表明pfs基因在不同鴨源雞桿菌中高度保守，其編碼的PFS蛋白相互之間可能產(chǎn)生交叉保護(hù)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，G7分離株與其分類(lèi)地位接近的巴斯德桿菌pfs基因的同源性，遠(yuǎn)高于大腸桿菌和沙門(mén)桿菌，這與Parveen等[4]的研究結(jié)果一致，初步推測(cè)該基因在細(xì)菌中高度保守又具有一定的種屬特異性。

鑒于pfs基因編碼的PFS在細(xì)菌內(nèi)普遍存在且高度保守，許多學(xué)者開(kāi)始關(guān)注PFS蛋白參與的甲硫氨酸代謝通路與細(xì)菌生長(zhǎng)和致病性的關(guān)系。范國(guó)博[9]等獲得了鴨疫里默氏桿菌的PFS蛋白，將禽致病性大腸桿菌和鴨疫里默氏桿菌的PFS蛋白共同作用于SAH，發(fā)現(xiàn)在體外條件下PFS蛋白可以催化SAH生成AI-2信號(hào)分子。曹素芳等[10]研究表明，原核表達(dá)制備的致病性大腸桿菌重組蛋白LuxS和PFS共同作用，可催化SAH產(chǎn)生AI-2信號(hào)分子。本試驗(yàn)將含有鴨源雞桿菌G7株完整閱讀框的pfs基因重組至原核表達(dá)質(zhì)粒pET-30a，利用T7啟動(dòng)子啟動(dòng)目的蛋白的表達(dá)，可表達(dá)出約28 kD的蛋白產(chǎn)物，表明構(gòu)建的重組表達(dá)載體能穩(wěn)定、高效地表達(dá)，為后期開(kāi)展PFS蛋白對(duì)鴨源雞桿菌的生長(zhǎng)特性和致病性影響等方面的研究奠定了基礎(chǔ)。