梁 艷，張 峰

（1.河南應(yīng)用技術(shù)職業(yè)學(xué)院，河南 鄭州450040； 2.開(kāi)封市食品藥品檢驗(yàn)所，河南 開(kāi)封 475001）

女金膠囊是由當(dāng)歸、白芍、川芎等23 味藥材組成的復(fù)方制劑，具有益氣養(yǎng)血、理氣活血、止痛的功效［1］，方中藥材主要成分阿魏酸、芍藥苷、桂皮醛、橙皮苷有抗炎、抗氧化等作用［2］，毛蕊花糖苷有抗血栓、抗腫瘤等作用［3］，歐前胡素、延胡索乙素有鎮(zhèn)痛作用［4］，其活性均與女金膠囊臨床作用密不可分。前期報(bào)道采用HPLC 法測(cè)定女金膠囊中芍藥苷、橙皮苷、黃芩苷、丹皮酚含量［5?7］，但尚未涉及其君藥當(dāng)歸、川芎中的主要成分阿魏酸。另外，歐前胡素、延胡索乙素、毛蕊花糖苷由于含量太低，無(wú)法采用傳統(tǒng)HPLC 法及紫外檢測(cè)器進(jìn)行定量。

UPLC?MS／MS 法與HPLC 法相比，具有專屬性強(qiáng)、分析時(shí)間短、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，而且通過(guò)不同化合物的特征母離子與其子離子的對(duì)應(yīng)關(guān)系可解決復(fù)雜樣品準(zhǔn)確定性定量問(wèn)題。因此，本實(shí)驗(yàn)首次建立UPLC?MS／MS 法同時(shí)測(cè)定女金膠囊中益母草堿、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、延胡索乙素、橙皮苷、黃芩苷、桂皮醛、甘草酸、歐前胡素的含量，以期為該制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料

ACQUITY UPLC H?Class Plus Xevo TQ?S Micro三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)Waters 公司），配置Mass Lynx 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、ESI 離子源；New Classic電子天平（十萬(wàn)分之一，瑞士Mettler?Toledo 公司）；KQ?250ES 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；JH?A 超純水機(jī)（江輝環(huán)保科技有限公 司）。女金膠囊（批號(hào) 200712、200816、200912）購(gòu)自藥店。阿魏酸（110773?201614，純度99.0%）、毛蕊花糖苷（111530?201914，純度95.2%）、芍藥苷（110736?201035，純度96.5%）、鹽酸益母草堿（11823?201704，純度94.3%）、甘草酸銨（110731?202021，純度96.2%）、橙皮苷（110721?201617，純度96.1%）、歐前胡素（110826?201415，純度99.7%）、延胡索乙素（110726?201819，純度99.8%）、桂皮醛（110710?201821，純度99.6%）、黃芩苷（110715?201016，純度93.3%）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇、甲酸、乙腈為色譜純（美國(guó)Fisher Scientific 公司）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜Phenomenex Kinetex C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，2.6 μm）；流動(dòng)相0.1% 甲酸（A）?乙腈（B），梯度洗脫（0～0.5 min，10%B；0.5～2 min，90%～70%B；2～8 min，70%～20%B；8～8.2 min，20%～90%B；8.2～10 min，10%B）；體積流量0.40 mL／min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜 ESI 離子源；MRM 模式，正負(fù)離子切換掃描；毛細(xì)管電壓3.1 kV；錐孔電壓40 V；源區(qū)溫度148 ℃；干燥氣溫度480 ℃，體積流量950 L／h；霧化器壓力250 kPa；霧化氣N2；碰撞氣Ar。其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 各成分質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters for various constituents

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取鹽酸益母草堿、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、延胡索乙素、桂皮醛、甘草酸銨、歐前胡素、橙皮苷、黃芩苷對(duì)照品適量，用溶劑A（量取50%乙腈2 L，加入2.0 mL甲酸，混合均勻）超聲溶解稀釋，作為對(duì)照品溶液①，各成分質(zhì)量濃度分別為0.051 10、0.810 4、0.050 55、0.010 02、0.020 28、1.521、1.533、0.406 4、0.404 4、0.203 4 g／L。精密量取5 mL，置于20 mL 量瓶中，溶劑A 稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液②。

2.2.2 供試品溶液 取膠囊20 粒，傾去內(nèi)容物，混勻，取約0.2 g，精密稱定，置于250 mL 燒瓶中，加入70%乙醇約100 mL，80 ℃水浴加熱回流提取70 min，放冷，濾過(guò)，濾液過(guò)濾至250 mL 量瓶中，50 mL 70% 乙醇洗滌殘?jiān)偌尤爰姿峒s0.25 mL 至量瓶中，70%乙醇稀釋至刻度，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 參照文獻(xiàn)［1］ 報(bào)道的處方，取除當(dāng)歸、白芍、川芎、熟地黃、甘草、肉桂、益母草、牡丹皮、醋延胡索、白芷、黃芩、陳皮以外的其他13 味藥材，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察 取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，各成分的分離度和峰形良好，陰性無(wú)干擾。

圖1 各成分MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of various constituents

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液②，用溶劑A 按適當(dāng)比例稀釋成系列質(zhì)量濃度，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），各對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，并分別以S／N ＝10、S／N ＝3 為定量限、檢測(cè)限，結(jié)果見(jiàn)表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液②，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定7 次，測(cè)得益母草堿、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、延胡索乙素、橙皮苷、黃芩苷、桂皮醛、甘草酸、歐前胡素峰面積RSD 分別為2.73%、2.52%、2.30%、3.51%、2.90%、2.84%、2.42%、2.72%、2.03%、3.81%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取膠囊（批號(hào)200712）6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得益母草堿、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、延胡索乙素、橙皮苷、黃芩苷、桂皮醛、甘草酸、歐前胡素峰面積RSD 分別為 2.32%、2.45%、3.33%、3.65%、2.93%、2.62%、2.11%、2.57%、2.20%、3.01%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3.4”項(xiàng)下供試品溶液，于0、2、4、8、12、20、24 h 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得益母草堿、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、延胡索乙素、橙皮苷、黃芩苷、桂皮醛、甘草酸、歐前胡素峰面積RSD 分別為2.55%、2.12%、2.88%、3.58%、2.93%、2.62%、3.36%、2.57%、2.67%、3.01%，表 明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各成分含量已知的膠囊9 份，每份約0.1 g，置于250 mL 燒瓶中，精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液②0.5、1、1.5 mL，每個(gè)質(zhì)量濃度3 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，益母草堿、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、延胡索乙素、橙皮苷、黃芩苷、桂皮醛、甘草酸、歐前胡素平均加樣回收率分別為98.80%、96.61%、98.05%、97.32%、99.34%、98.95%、97.83%、97.55%、99.43%、99.94%，RSD 分別為2.30%、1.76%、2.29%、2.74%、2.30%、2.28%、2.55%、2.73%、2.30%、2.44%。

2.3.7 樣品含量測(cè)定 取3 批膠囊（編號(hào)S1～S3），每批2 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各成分含量測(cè)定結(jié)果（mg／g， n＝2）Tab.3 Results of content determination of various constituents（mg／g， n＝2）

3 討論與結(jié)論

查閱文獻(xiàn)［8?10］，本實(shí)驗(yàn)曾采用70%乙醇超聲提取，但發(fā)現(xiàn)桂皮醛、歐前胡素提取效率不高，故選擇回流提取。再考察了提取溶劑50% 乙醇、70%乙醇、乙醇，80 ℃水浴加熱回流30、45、60、75 min，發(fā)現(xiàn)用70% 乙醇提取時(shí)效率最高，提取60 min后各成分含量不再增加；提取75 min 時(shí)，芍藥苷、桂皮醛、歐前胡素含量稍有下降。最終確定，提取方法為80 ℃水浴中用70%乙醇加熱回流60 min。

本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇?水、乙腈?水、甲酸?水等洗脫系統(tǒng)［11?16］，發(fā)現(xiàn)以0.1%甲酸?乙腈為流動(dòng)相時(shí)各成分峰形、分離度均符合要求，同時(shí)考慮到溶劑效應(yīng)的存在，采用流動(dòng)相來(lái)稀釋樣品。由于毛蕊花糖苷含量較低，為保證其靈敏度，對(duì)其保留時(shí)間±0.5 min范圍內(nèi)的駐留時(shí)間進(jìn)行手動(dòng)分配和分段掃描，同時(shí)為了防止保留時(shí)間接近的待測(cè)組分互相干擾，又采用了正負(fù)離子切換掃描方式，采集模式選擇MRM，可保證方法專屬性。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)首次采用UPLC?MS／MS 法同時(shí)測(cè)定女金膠囊中的10 種成分，發(fā)現(xiàn)該方法具備專屬性強(qiáng)、速度快、靈敏度高、節(jié)省溶劑的特點(diǎn)，可為提高該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。