潘振亞 趙 娜 馬晨瑜 祝韻薇 鄧 旻

膿毒癥是由于宿主對感染的反應(yīng)失調(diào)而產(chǎn)生威脅生命的器官功能障礙[1]，是臨床常見危重癥，極易導(dǎo)致患者死亡。研究表明，當(dāng)機(jī)體發(fā)生膿毒癥時，腸道菌群多樣性及豐度發(fā)生顯著變化，而菌群的代謝產(chǎn)物與心肌能量代謝、線粒體功能及炎癥反應(yīng)存在密切相關(guān)性[2-3]。前期研究發(fā)現(xiàn)，扶正祛瘀通下法可改善膿毒癥大鼠肝、腎等臟器功能，并且可以有效保護(hù)腸道屏障功能[4-5]。本研究繼續(xù)以參附桃紅承氣湯為方，基于代謝組學(xué)探討扶正祛瘀通下法對膿毒癥大鼠心肌損傷的保護(hù)機(jī)制?，F(xiàn)報道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF 級Wistar 雌、雄大鼠各15 只，體質(zhì)量（200±20）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)研究中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2018-0006，動物實(shí)驗(yàn)許可證號：SYXK（浙）2018-0012。大鼠自由飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（21±2）℃，濕度（55±5）%。本研究經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理與倫理委員會審核，批準(zhǔn)編號：20190805-07。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，購自美國Sigma 公司，批號L2880），H-7650 透射電子顯微鏡（日本日立公司），小動物超聲系統(tǒng)（Fuji film 公司vevo1100 系統(tǒng)），超高效液相色譜儀（美國Waters 公司，型號：ACQUITY UPLC）、質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX 公司，型號：TOF-5600）、NewClassic MS 電子天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司，型號：NewClassic MF MS105DU）、冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf 公司，型號：Centrifuge 5424 R）。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 太子參20g，制附子、紅花、桃仁、芒硝、生大黃、桂枝、厚樸、枳實(shí)、甘草各10g，由杭州市紅十字會醫(yī)院藥劑科提供，濃煎至8g/mL，過濾除菌分裝，4℃保存。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與造模 30 只Wistar 大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、實(shí)驗(yàn)組、空白對照組，每組10 只。模型組及實(shí)驗(yàn)組大鼠在麻醉后采用單次腹腔注射脂多糖10mg/kg 方法建立大鼠膿毒癥模型?？瞻讓φ战M給予單次腹腔注射生理鹽水。若大鼠在給藥6h 后出現(xiàn)精神萎靡、活動減少、刺激反應(yīng)減弱等現(xiàn)象，證明造模成功。

2.2 給藥方法 從造模前3 天開始給藥，實(shí)驗(yàn)組給予中藥1mL 灌胃，生藥劑量為8g/只，2 次/天；模型組予以生理鹽水1mL 灌胃，2 次/天；空白對照組給予生理鹽水1mL 灌胃，2 次/天；至大鼠造模后12h，檢測各組大鼠心功能后處死大鼠。

2.3 標(biāo)本采集與檢測

2.3.1 心臟超聲評估心功能 各組大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔麻醉后通過小動物超聲儀取左室乳頭肌水平短軸切面，檢測大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF），取3個心動周期的平均值記錄數(shù)據(jù)。

2.3.2 心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察 各組大鼠在處死后迅速打開胸腔摘取心臟，取左心室約5mm 厚心肌組織，使用4%戊二醛灌注固定24h，再用PBS 溶液洗滌3 次，在1%鋨酸中固定3h，梯度經(jīng)乙醇和無水丙酮脫水、氧化丙烯置換、環(huán)氧樹脂包埋，經(jīng)染色后使用透射電子顯微鏡觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)并拍照。

2.3.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS）分析 在距盲腸2cm 前剪開腸管，取糞便在-80℃下凍存，用時取待檢測糞便樣本50mg 置于EP 管中，加入400μL 80%的甲醇水溶液，渦旋振蕩，于-20℃環(huán)境中靜置30min，離心（13000r/min、4℃）15min，取上清液進(jìn)行LC-MS 分析。（1）色譜條件：色譜柱為BEHC18 柱（100mm×2.1mm i.d.，1.7μm；Waters，Milford，USA）；流動相A為水（含0.1%甲酸），流動相B 為乙腈/異丙醇（1/1）（含0.1%甲酸）；梯度洗脫程序?yàn)?～3min：0～20%B，3～9min：20%～60%B，9～11min：60%～100%B，100%B維持2.5min，13.5～13.6min：100%～0%B，0%B 維持2.4min。流速為0.40mL/min，進(jìn)樣量為20μL，柱溫為40℃。（2）質(zhì)譜條件：樣品質(zhì)譜信號采集分別采用正負(fù)離子掃描模式，電噴霧毛細(xì)管電壓，進(jìn)樣電壓和碰撞電壓分別為1.0kV、40.0V和6.0eV。離子源溫度和去溶劑溫度分別為120℃和500℃，載氣流量900L/h，質(zhì)譜掃描范圍50～1000m/z，分辨率為30000。（3）數(shù)據(jù)采集及分析：將LC-MS 獲得的質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入代謝組學(xué)處理軟件Progenesis QI（Waters Corporation，Milford，USA）進(jìn)行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊等預(yù)處理，得到的數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行歸一化處理后采用SIMCA-P+14.0 軟件（Umetrics）進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）、有監(jiān)督偏最小二乘法判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）和正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）等多維統(tǒng)計(jì)分析。采用PLS-DA 模型第一主成分的變量投影重要度（VIP）值、差異倍數(shù)（FC）、并結(jié)合T-test 的P 值進(jìn)行差異代謝物的篩選，并利用Metabo Analyst 網(wǎng)站對鑒定出的差異代謝物進(jìn)行代謝通路分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 24.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t 檢驗(yàn)，P<0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠LVEF 值比較與空白對照組比較，模型組及實(shí)驗(yàn)組大鼠LVEF 值均下降（P＜0.05）；與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠LVEF 值顯著升高（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠LVEF 值比較（%，±s）

表1 各組大鼠LVEF 值比較（%，±s）

注：空白對照組及模型組給予1mL/次生理鹽水灌胃，2 次/天；實(shí)驗(yàn)組給予1mL/次參附桃紅承氣湯灌胃，2 次/天；LVEF 為左心室射血分?jǐn)?shù)；與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

3.2 各組大鼠電鏡下心肌超微結(jié)構(gòu) 空白對照組大鼠心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)完整，脊線完好無損，未見明顯腫脹、空泡化等情況；實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)少量線粒體損傷及脊線斷裂，而模型組有大量的線粒體腫脹、壞死，并且出現(xiàn)脊斷裂及空泡化。見圖1。

圖1 各組大鼠電鏡下心肌超微結(jié)構(gòu)（×15000）

3.3 各組大鼠代謝組學(xué)分析情況

3.3.1 PCA 分析 利用PCA 進(jìn)行各組大鼠腸道代謝物之間的差異性分析，可見各組大鼠代謝物正、負(fù)離子模式下均產(chǎn)生了明顯分離。見圖2。

圖2 陽離子（A、C）和陰離子（B、D）模式下各組大鼠代謝PCA 圖

3.3.2 PLS-DA 分析 進(jìn)一步對模型組和實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)行PLS-DA 分析，在正、負(fù)離子模式下，模型組與實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)明顯分離，組內(nèi)聚合度較高，結(jié)果與PCA 分析基本一致。見圖3。

圖3 陽離子（A）和陰離子（B）模式下模型組和實(shí)驗(yàn)組大鼠代謝PLS-DA 圖

3.3.3 差異代謝物篩選及代謝通路分析 以O(shè)PLSDA 模式判別中的VIP>1 以及P＜0.05 為條件，進(jìn)行差異代謝物篩選，共篩選出81個差異代謝物，其中正離子模式下52個，負(fù)離子模式下29個，通過火山圖可以看出距離中心越遠(yuǎn)的點(diǎn)越可能成為差異代謝物（見圖4）。最終共鑒定出9個對分類貢獻(xiàn)較大的代謝物作為膿毒癥心肌損傷后相關(guān)的差異代謝物。使用Metaboanalys 軟件對9個差異代謝產(chǎn)物進(jìn)行代謝通路的富集分析，共獲得了6 條代謝通路。見表2、圖5。

圖5 差異代謝物代謝通路分析

表2 各差異代謝物信息表

圖4 差異代謝物火山圖

4 討論

本研究代謝組學(xué)分析結(jié)果顯示，與模型組比較，經(jīng)中藥干預(yù)后的實(shí)驗(yàn)組上調(diào)苯甲酸鹽代謝、黃酮類生物合成及酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸代謝，下調(diào)類固醇激素生物合成等代謝通路。

黃酮類化合物具有抗氧化和清除自由基、抗炎、抗菌和改善微循環(huán)等作用[6]。山奈酚可以促進(jìn)缺氧心肌細(xì)胞增殖、抑制缺氧心肌細(xì)胞凋亡、降低活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）水平和抑制自噬[7]；芹菜素可通過對環(huán)氧化酶-2（COX-2）和核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）活性的抑制而減少促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并且可抑制自由基的過氧化反應(yīng)，激活組織中氧化酶的活性來發(fā)揮抗心肌缺血作用[8]；蘆薈苷通過激活蛋白激酶B（AKT）/內(nèi)皮型一氧化氮（eNOS）信號通路抑制心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡，從而改善缺血再灌注大鼠心肌損傷[9]。柚皮素是柚皮甙的甙元，屬二氫黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和心肌保護(hù)活性[10]。柚皮素可抑制炎癥相關(guān)因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）等表達(dá)水平，并且通過促凋亡蛋白因子Bax降低、抗凋亡蛋白因子Bcl-2 增加等途徑來減輕心肌細(xì)胞的炎癥與凋亡[11]。參附桃紅承氣湯可能通過抗氧化、抑制心肌細(xì)胞凋亡等途徑減輕膿毒癥大鼠心肌損傷。

色氨酸是人體必需氨基酸之一，可參與體內(nèi)血漿蛋白質(zhì)的更新。色氨酸最終可以通過5 羥色胺（5-HT）與犬尿氨酸（kyn）兩條途徑進(jìn)行分解代謝，5 羥基吲哚乙酸是5-HT 代謝途徑的產(chǎn)物[12]。研究表明，5-HT 可與血管平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞膜相應(yīng)受體結(jié)合，激活磷脂酶后產(chǎn)生的三磷酸肌醇與受體再結(jié)合，Ca2+內(nèi)流通道激活，使血管收縮、升高血壓。另有研究表明，5-HT通過介導(dǎo)5-羥色胺受體4（5-HTR4）使心肌收縮力增強(qiáng)，從而達(dá)到正性肌力的效果[13-14]；酪氨酸是人體的條件必需氨基酸和生酮生糖氨基酸，經(jīng)酪氨酸脫羧酶的催化可轉(zhuǎn)成酪胺，再進(jìn)一步代謝可生成N-甲基酪胺。N-甲基酪胺可增加冠脈血流量和腎血流量，降低心肌耗氧量，具有顯著的抗休克效果；異亮氨酸是人體必需氨基酸之一，是最有效的一種支鏈氨基酸，亮氨酸協(xié)同纈氨酸修復(fù)肌肉，控制血糖，并為身體組織提供能量。據(jù)研究表明，異亮氨酸可刺激哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）磷酸化，可顯著正調(diào)控mTOR通路[15]。參附桃紅承氣湯可能通過調(diào)節(jié)色氨酸、酪氨酸、異亮氨酸等氨基酸代謝來緩解膿毒癥大鼠心肌損傷。

靈芝酸是一種三萜類物質(zhì)，可抑制IL-1β、IL-6和TNF-α 等炎癥因子的表達(dá)，同時可抑制氧化應(yīng)激及抑制Toll 樣受體（TLRs）/NF-κB信號通路和凋亡信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)，從而達(dá)到減輕大鼠心肌損傷的效果[16]。

7-脫氫膽固醇由膽固醇轉(zhuǎn)化而來，屬于固醇類物質(zhì)。高膽固醇血癥是缺血性心臟病發(fā)生發(fā)展的重要危險因素。與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠腸道代謝產(chǎn)物中7-脫氫膽固醇顯著減少，說明參附桃紅承氣湯可能通過調(diào)整脂質(zhì)代謝來改善心肌損傷情況。

綜上所述，扶正祛瘀通下法（參附桃紅承氣湯）改善膿毒癥大鼠心肌損傷的主要代謝通路包括黃酮類的合成、氨基酸代謝、苯丙酸代謝、類固醇激素生物合成等途徑。