嚴(yán)卿瑩 劉云霞 姚勇偉 王翌慶 楊潔文 徐葉峰

原發(fā)性骨腫瘤是發(fā)生于骨骼或其附屬組織的腫瘤，包括骨肉瘤、軟骨肉瘤及尤文肉瘤，具有惡性程度高、易致殘等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅兒童及青少年的健康。盡管骨腫瘤在所有癌癥中的所占比例不足0.2%，但在過去十年中，其發(fā)病率以每年0.3%的速度增長(zhǎng)[1]。我國(guó)人口基數(shù)龐大，據(jù)研究統(tǒng)計(jì)，2014 年我國(guó)約有24，000例新確診病例和17，200例死亡病例，發(fā)病率為1.32/100，000[2]。不同類型的骨腫瘤治療方式略有差異，其共同目標(biāo)均為提高生活質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期[3]。新輔助化療、輔助化療結(jié)合手術(shù)是治療骨腫瘤的首選，然而腫瘤的耐藥、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。

中醫(yī)藥治療腫瘤，有增效減毒之功效。然而中藥成分復(fù)雜，作用靶點(diǎn)較多，抗腫瘤機(jī)制尚未明確，在臨床運(yùn)用中仍存在一定局限性。因此，本文通過收集中醫(yī)藥治療原發(fā)性骨腫瘤的文獻(xiàn)，應(yīng)用現(xiàn)代信息技術(shù)挖掘中醫(yī)藥臨床治療骨腫瘤的用藥規(guī)律及潛在藥物組合，并通過構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，探究中醫(yī)藥治療骨腫瘤潛在的作用機(jī)制，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 檢索方法 以“中醫(yī)”“中醫(yī)藥”“中藥”“中西結(jié)合”“中西醫(yī)”“骨肉瘤”“骨腫瘤”“骨惡性腫 瘤”“尤 文肉瘤”為主題詞，檢索中國(guó)知網(wǎng)（CNKI）、萬方數(shù)據(jù)知識(shí)服務(wù)平臺(tái)、維普網(wǎng)1979 年1 月—2020 年2 月收錄的文獻(xiàn)。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：采用有明確藥物組成的中藥或成藥組方治療骨腫瘤的臨床研究、病例報(bào)告研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）動(dòng)物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究；（2）純理論類文獻(xiàn)；（3）組方不明的中藥及中成藥治療骨腫瘤的研究；（4）針灸及外用中藥治療骨腫瘤的研究；（5）治療對(duì)象為轉(zhuǎn)移性骨腫瘤的研究。

1.3 藥物統(tǒng)計(jì) 文獻(xiàn)中方劑組成藥物及其加減藥物均予統(tǒng)計(jì)，若為病例報(bào)道，則取首次就診資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。中藥名稱及性味歸經(jīng)參照《中華本草》[4]及“十二五”全國(guó)高等中醫(yī)藥院校規(guī)劃教材《中藥學(xué)》[5]，如將生地轉(zhuǎn)化為生地黃，熟地轉(zhuǎn)化為熟地黃，米仁轉(zhuǎn)化為薏苡仁，旱蓮草轉(zhuǎn)化為墨旱蓮，旋復(fù)花轉(zhuǎn)化為旋覆花，元參轉(zhuǎn)化為玄參，銀花藤轉(zhuǎn)化為忍冬藤，鹿含草轉(zhuǎn)化為鹿銜草等。

1.4 聚類統(tǒng)計(jì) 使用Excel 2016 軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，將文獻(xiàn)編號(hào)，提取藥物名稱，性味歸經(jīng)等數(shù)據(jù)，將處方涉及到的藥物進(jìn)行二值量化，如果出現(xiàn)則錄為“1”，否則錄為“0”，運(yùn)用IBM SPSS Statistics 24.0 進(jìn)行聚類分析，通過SPSS Modeler 18.0 分析高頻藥物之間的關(guān)聯(lián)度，設(shè)置“類型”和“設(shè)為標(biāo)志”兩個(gè)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行中藥網(wǎng)絡(luò)化展示，并創(chuàng)建Apriori 模型，對(duì)藥物進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析。

1.5 高頻藥物預(yù)測(cè)靶點(diǎn) 在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中查找最高頻藥物的分子信息，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30，藥物半衰期（half-life，HL）≥4h，類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 為條件，篩選活性成分，取分子結(jié)構(gòu)圖或典型smiles 結(jié)構(gòu)，上傳至ChemMapper（http://lilab.ecust.edu.cn/chemmapper/）數(shù)據(jù)庫(kù)，并設(shè)定3D 相似性>0.85，預(yù)測(cè)活性成分的可能作用靶點(diǎn)。

1.6 骨腫瘤的預(yù)測(cè)靶點(diǎn) 于DisGENT 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.disgenet.org）及TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://db.idrblab.net/ttd/）中，以“Bone sarcoma”“Malignant bone neoplasm”“Osteosarcoma”等關(guān)鍵詞檢索骨腫瘤的潛在靶點(diǎn)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)，設(shè)定得分>0.04 的目標(biāo)靶點(diǎn)作為骨腫瘤的潛在靶點(diǎn)。

1.7 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與信號(hào)通路分析 使用Cytoscape 3.2.1 軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并通過其插件CentiScape 分析網(wǎng)絡(luò)以計(jì)算拓?fù)鋮?shù)，以自由度、介數(shù)等參數(shù)驗(yàn)證成分及靶點(diǎn)的重要性，將黃芪治療骨腫瘤的相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入ClueGO 插件進(jìn)行分析，設(shè)定P≤0.01，以Reactome pathways 富集通路分析高頻藥物治療骨腫瘤的可能機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 藥物使用頻次分析 本研究納入29 篇文獻(xiàn)，共30 張?zhí)幏?，統(tǒng)計(jì)藥味145 味藥，總頻次436 次。其中黃芪用藥頻次最高，共19 次，單味用藥次數(shù)/總體用藥次數(shù)（頻率1）為4.36%，單味藥用藥次數(shù)/處方數(shù)（頻率2）為63.33%，使用頻次較高的前10 味中藥依次為黃芪、甘草、白術(shù)、當(dāng)歸、熟地黃、茯苓、山藥、補(bǔ)骨脂、黨參、牡丹皮，見表1。

表1 骨腫瘤高頻藥物使用情況

2.2 藥物類別頻數(shù)分析 將145 味中藥進(jìn)行分類，主要有補(bǔ)虛藥、清熱藥、活血化瘀藥、化痰止咳平喘藥、利水滲濕藥、解表藥、祛風(fēng)濕藥、平肝熄風(fēng)藥、理氣藥、消食藥、化濕藥、止血藥、溫里藥、收澀藥、安神藥、攻毒殺蟲止癢藥、瀉下藥共17 大類。累積頻率最高為補(bǔ)虛藥，共30 次，頻率（該藥物類別用藥頻次/總藥物類別有效數(shù)據(jù)）為20.69%，其次為清熱藥及活血化瘀藥。見表2。

表2 藥物類別使用情況

2.3 藥物性味頻數(shù)分析 將所有藥物進(jìn)行藥性和藥味頻數(shù)分析，其中藥味使用頻次最高者為甘味藥物，共71 次，占藥性總數(shù)比例為29.71%（該藥味用藥頻次/藥味有效數(shù)據(jù)總數(shù)）；藥性使用頻次最高者為溫藥，共43 次，占藥性總數(shù)比例為29.66%（該藥性用藥次數(shù)/藥性有效數(shù)據(jù)總數(shù)）。見表3。

表3 不同性味藥物使用頻率

2.4 藥物歸經(jīng)分析 對(duì)所有藥物的歸經(jīng)進(jìn)行頻數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)歸經(jīng)頻數(shù)最高的是肝經(jīng)，共87 次，占?xì)w經(jīng)總數(shù)比例為24.44%（該經(jīng)的頻數(shù)/總歸經(jīng)有效頻數(shù)），其次為腎經(jīng)、脾經(jīng)、胃經(jīng)。見表4。

表4 不同歸經(jīng)藥物使用頻率

2.5 高頻藥物聚類分析 對(duì)高頻藥物（頻數(shù)≥5）進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，共得到三類。類一，共包含牛膝、桑枝、斑蝥、骨碎補(bǔ)、菊花、鹿角膠、山楂、山茱萸、澤瀉、牡丹皮、山藥、熟地黃、補(bǔ)骨脂、杜仲14 味藥，以補(bǔ)腎填精為主；類二，包含夏枯草、半夏、竹茹、薏苡仁4味藥，以化痰利濕散結(jié)為主；類三，包含白芍、白術(shù)、當(dāng)歸、黨參、黃芪、甘草、茯苓7 味藥，以補(bǔ)益氣血為主。見圖1。

圖1 用藥聚類分析樹狀圖

2.6 高頻藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則分析 對(duì)高頻藥物（頻數(shù)≥5），使用SPSS Modeler 18.0 軟件進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，對(duì)高頻藥物進(jìn)行中藥網(wǎng)絡(luò)化展示（見圖2），其中線條粗細(xì)程度表示兩種藥物之間的關(guān)聯(lián)度的強(qiáng)弱。利用Apriori 建模挖掘藥物之間的配伍關(guān)系，設(shè)置最小支持度為25%，最小置信度為90%，最大前項(xiàng)數(shù)為5，提升度＞1，共挖掘核心藥對(duì)六組，見表5。

表5 高頻藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

圖2 高頻藥物治療骨腫瘤的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析 TCMSP 中共包含87個(gè)黃芪的主要成分，根據(jù)活性成分篩選條件，可得到16個(gè)主要成分，其預(yù)測(cè)靶點(diǎn)情況見表6。對(duì)16個(gè)活性成分及其預(yù)測(cè)靶點(diǎn)進(jìn)行成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，其中有51個(gè)節(jié)點(diǎn)，包括16個(gè)成分節(jié)點(diǎn)和35個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)（見圖3），其中成分節(jié)點(diǎn)以菱形顯示，預(yù)測(cè)靶點(diǎn)以橢圓形節(jié)點(diǎn)顯示，節(jié)點(diǎn)顏色根據(jù)自由度（degree）由大到小從橙紅色到黃色顯示。結(jié)果顯示，樺木酸自由度為17，介數(shù)為0.19066，為黃芪治療骨腫瘤中發(fā)揮的主要成分（見表7），而GSK-3β 為16個(gè)成分的共有靶點(diǎn)，因此我們認(rèn)為GSK-3β 是黃芪治療骨腫瘤的最主要靶點(diǎn)，ESR1、PPARG、PTGS2 亦為重要靶點(diǎn)，見表8。

表7 黃芪各成分的自由度及介數(shù)

表8 主要靶點(diǎn)的自由度及介數(shù)

圖3 黃芪治療骨腫瘤的成分-靶點(diǎn)圖

表6 黃芪活性成分及其預(yù)測(cè)靶點(diǎn)

2.8 信號(hào)通路富集 在GlueGO 里面導(dǎo)入35個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，設(shè)定每條通路里面最少靶點(diǎn)為5個(gè)，如圖4所示，黃芪治療骨腫瘤的主要富集在PI3K/Akt信號(hào)通路、RUNX2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、白介素4/13信號(hào)通路、EPH-Ephrin信號(hào)通路。

圖4 主要靶點(diǎn)通路富集圖

3 討論

早在《五十二病方》中就有“骨?。ň遥庇涊d，中醫(yī)將骨腫瘤歸屬“骨瘤”“骨疽”“石疽”“肉瘤”“石癰”等范疇。該病多由于先天稟賦不足，正氣虧虛，寒濕毒邪乘虛而入，阻滯經(jīng)絡(luò)，結(jié)毒成瘤，留滯骨骼而成。治療上多以健脾益氣、補(bǔ)腎填精、清熱利濕、活血化瘀、化痰散結(jié)之法，故多數(shù)醫(yī)家遣方多用補(bǔ)虛藥、清熱藥及活血化瘀藥。

“邪之所湊，其氣必虛”，正虛邪盛為骨肉瘤發(fā)生的重要病機(jī)，現(xiàn)代醫(yī)家認(rèn)為，扶正固本在骨腫瘤的治療上尤為重要[6]。通過匯總骨腫瘤臨床研究的文獻(xiàn)，結(jié)果顯示骨腫瘤的治療中用藥次數(shù)最多者為黃芪。黃芪在臨床的應(yīng)用可最早追溯至先秦的《五十二病方》，用于治療疽病，《神農(nóng)本草經(jīng)》也記載了黃芪“主癰疽久敗創(chuàng)，排膿止痛”之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，黃芪可增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞及體液免疫，減少放化療的毒副作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[7]。通過高頻藥物聚類分析發(fā)現(xiàn)，第三類補(bǔ)益氣血組合以八珍湯為主藥，加益氣固表之黃芪，以達(dá)到正氣足則邪自去之功效。通過對(duì)高頻藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，六對(duì)藥物組合均以黃芪為主，或配伍養(yǎng)血、或配伍化瘀、或加以補(bǔ)腎、或加以益氣，提示骨腫瘤的治療常以益氣、補(bǔ)腎、養(yǎng)血、化瘀相互配伍進(jìn)行。

骨腫瘤病位在骨，多由于腎精虧虛、勞倦內(nèi)傷、骨髓空虛，熱毒、寒濕之邪氣入侵，氣血痰濕郁結(jié)所致[8]。聚類分析顯示，第一類藥物組合主要以六味地黃丸及陽(yáng)和湯為主之補(bǔ)腎填精藥?！锻饪普凇酚性疲骸澳I主骨，恣欲傷腎，腎火郁遏，骨無榮養(yǎng)而為腫曰骨瘤?！庇衷疲骸岸喙蔷艺?，由瘡潰久不收口，氣血不能運(yùn)行，骨無榮養(yǎng)所致?！北砻髂I氣不足，腎陰虧虛是骨腫瘤發(fā)病的根本。骨腫瘤患者多以兒童及青少年為主，小兒陽(yáng)常有余、陰常不足，六味地黃丸為滋陰補(bǔ)腎的首方，可作為治療骨腫瘤的常用方劑?！鹅`樞》記載“陽(yáng)化氣，陰成形”“溫氣不行，凝血蘊(yùn)里而不散，津液澀滲，著而不去，而積皆成矣”?，F(xiàn)代醫(yī)家認(rèn)為，陽(yáng)虛陰盛是腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移的核心病機(jī)[9]。陽(yáng)和湯溫養(yǎng)陽(yáng)氣而不傷陰，填補(bǔ)精血而不留痰瘀，散寒而不耗散氣血，并有減毒增效、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、減輕癌痛之功效，為治療惡性腫瘤的基本方[10]。腎為藏陰蘊(yùn)陽(yáng)之臟，無陽(yáng)則陰無以生，無陰則陽(yáng)無以化，在骨腫瘤的治療中，巧用陽(yáng)和湯可達(dá)到“寒凝一解，氣血乃行，毒亦隨之消”之功效。

腎為主水之臟，水液代謝失衡，則產(chǎn)生痰飲、水濕。痰濕之邪與腫瘤的產(chǎn)生密切相關(guān)，“久郁之痰，有年痼疾”，痰為濕化，多為陰邪，常留滯四肢關(guān)節(jié)，因此在骨腫瘤的治療中，多輔以化痰利濕散結(jié)之藥。高頻藥物中，半夏及竹茹，一溫一寒，結(jié)合利濕之薏苡仁，散結(jié)之夏枯草，組成第二類藥物組合，可達(dá)到濕去熱消、痰瘀自散的效果。

骨腫瘤最主要的臨床表現(xiàn)為腫脹、疼痛及活動(dòng)受限。匯總結(jié)果顯示，藥味頻數(shù)最高為甘味藥，藥性頻次最高為溫性藥。甘能補(bǔ)、能緩，具有補(bǔ)益和中，緩急止痛之功效。正所謂“不通則痛”，溫藥多具有溫里散寒、補(bǔ)火助陽(yáng)、溫通經(jīng)絡(luò)之功效，可在治療上顯著緩解骨腫瘤引起的疼痛。歸經(jīng)頻數(shù)分析結(jié)果顯示，高頻藥物多入肝、腎、脾胃經(jīng)，肝主筋、肝藏血而濡養(yǎng)筋脈，肝虛血虧則可導(dǎo)致活動(dòng)受限，腎主骨、腎精充足則骨骼得以滋養(yǎng)，腎虛可導(dǎo)致“不榮則痛”，脾主四肢，水谷清陽(yáng)之氣皆由脾氣輸布，脾氣虛，則四肢失于溫陽(yáng)，可見腫脹不舒。因此，治療骨肉瘤腫脹、肌力異常及術(shù)后恢復(fù)，多從肝、腎、脾胃經(jīng)入手。

樺木酸是一種三萜類化合物，具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎等作用，可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞等凋亡[11-15]。本研究結(jié)果顯示，黃芪治療骨腫瘤的主要成分是樺木酸，而主要靶點(diǎn)為糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）。GSK-3β 是一種進(jìn)化保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在細(xì)胞增殖、DNA 修復(fù)、細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝途徑等方面發(fā)揮重要作用，并與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，為軟組織肉瘤的治療靶點(diǎn)之一，其活化可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖[16-18]。Selzer 等[19]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樺木酸可以通過GSK-3β 促進(jìn)人黑色素瘤細(xì)胞的凋亡。GSK-3β 作為PI3K/Akt 的主要靶點(diǎn)，可能被Akt介導(dǎo)的Ser 9殘基磷酸化而失活，研究表明，PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路可抑制腫瘤細(xì)胞敏感性，從而促進(jìn)乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移[20-21]。黃芪治療骨腫瘤主要富集在PI3K/Akt信號(hào)通路，Cheng 等[22]認(rèn)為，通過Akt/GSK-3β/Snail信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。除此之外，黃芪治療骨腫瘤的重要靶點(diǎn)有ESR1、PPARG、PTGS2，并通過RUNX2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、白介素4/13信號(hào)通路、EPH-Ephrin信號(hào)通路發(fā)揮作用，可作為黃芪治療骨腫瘤的潛在研究機(jī)制。

綜上所述，本研究通過匯總相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤治療中，現(xiàn)代醫(yī)家多從扶正固本入手，遣方多用補(bǔ)虛藥、清熱藥及活血化瘀藥，常用八珍湯、六味地黃丸及陽(yáng)和湯，可為骨腫瘤的中醫(yī)治療提供理論基礎(chǔ)。同時(shí)，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，初步分析了中醫(yī)藥治療骨腫瘤高頻用藥為黃芪，其中活性成分樺木酸發(fā)揮了主要作用，并主要作用于GSK-3β，通過PI3K/Akt信號(hào)通路發(fā)揮作用，為中醫(yī)藥治療骨腫瘤提供后續(xù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。然而納入中醫(yī)藥治療骨腫瘤的臨床研究偏少，且骨腫瘤的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、治療分期存在差異，證型、癥狀等與用藥關(guān)系尚未進(jìn)一步研究，因此研究結(jié)果需要經(jīng)過基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及完善的臨床研究加以證實(shí)。