張露露 余真君 何寶澤

自身免疫性肝炎（AIH）是一種以肝細胞破壞為特征的自身免疫性炎癥疾病，近年來其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢[1]。免疫抑制劑（潑尼松和硫唑嘌呤）是臨床治療AIH 的有效藥物，但這些藥物的骨髓抑制和庫欣綜合征等不良反應嚴重[2]。柚皮素是一種生物類黃酮，具有抗癌、抗誘變、抗炎和抗氧化等多種功能[3]。研究發(fā)現(xiàn)，柚皮素通過減少腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的積累和抑制細胞凋亡，對心肌缺血/再灌注損傷具有保護作用[4]。此外，柚皮素可以抑制四氯化碳誘導的小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的損傷[5]。刀豆球蛋白A（ConA）是一種植物凝集素，可促進T細胞有絲分裂并誘導AIH[6]。當用ConA 處理小鼠時，肝臟釋放白細胞介素-6（IL-6）、TNF-α和干擾素-γ（IFN-γ）等多種炎性細胞因子，從而導致肝組織發(fā)生凋亡和自噬[7]。因此，本研究探討柚皮素在ConA 誘導的AIH 中的保護作用及腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）/c-Jun 氨基末端激酶（JNK）信號通路的潛在作用，為柚皮素治療AIH 提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 72 只SPF 級雄性C57BL/6 小鼠，體質(zhì)量25～30g，購自中國醫(yī)藥研究開發(fā)中心有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0034，動物使用許可證號：SYXK（京）2019-0051，動物質(zhì)量合格證號：HG50131702，在溫度22～24℃、相對濕度50%～70%的環(huán)境中自由進食和飲水，控制飼養(yǎng)環(huán)境晝夜循環(huán)（12h/12h），適應性喂養(yǎng)1 周。本研究經(jīng)臺州恩澤醫(yī)療中心（集團）恩澤醫(yī)院倫理委員會審核通過，批件編號：LS-2020（字）0037 號。

1.2 主要藥物、試劑與儀器 柚皮素（原料藥，純度98%，湖南華騰制藥有限公司，批號93602-28-9）；硫唑嘌呤（上海信誼藥廠有限公司，規(guī)格：50mg/片，批號20200109）；ConA（美國Sigma 公司，批號11028-70）；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）檢測試劑盒（上海仁捷生物科技有限公司，批號080120、080122）；蘇木精-伊紅（HE）染色液（上海碧云天生物技術(shù)研究所，批號C0107）；IL-6和TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（北京方程生物科技有限公司，批號MM-0670R22、MM-0670R84）；RIPA 裂解液（上海生工生物工程有限公司，批號175056）；ECL 化學發(fā)光試劑盒（美國GE 公司，批號KL5179-23）；TRAF6、JNK、磷酸化JNK（p-JNK）、B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）和β-肌動蛋白（β-actin）抗體、山羊抗鼠二抗（美國Santa Cruz 公司，批號SC-5218、SC-5328、SC-5329、SC-4176、SC-5249、SC-6175、SC-0119）；全自動生化分析儀（日本Olympus 公司，型號AU2700）；組織脫水機、包埋機、全自動輪轉(zhuǎn)切片機等病理配套設備（德國Leica 公司，型號ASP200S、EG1160、RM2265）；光學顯微鏡（日本Nikon 公司，型號MM-800）；臺式冷凍離心機（德國Heraeus 公司，型號Sorvall STR ATOS）；酶標分析儀、垂直電泳儀（美國BIO-RAD 公司，型號xMark、1658000）；凝膠成像儀（美國UVP 公司，型號Gelstudio touch）。

1.3 分組、造模及給藥 按照隨機數(shù)字表法將72 只小鼠分為陰性對照組，模型組，柚皮素低（30mg/kg）、中（60mg/kg）、高（120mg/kg）劑量組[8]和陽性對照組（2mg/kg）[9]，每組12 只。模型組，柚皮素低、中、高劑量組和陽性對照組一次性尾靜脈注射ConA（12mg/kg）制備AIH 模型[10]，陰性對照組尾靜脈注射等量生理鹽水。注射完畢之后，柚皮素低、中、高劑量組分別給予柚皮素（劑量依次為30、60、120mg/kg，將柚皮素和生理鹽水配制成濃度分別為3、6、12mg/mL 的溶液，灌胃體積10mL/kg）灌胃；陽性對照組給予硫唑嘌呤（2mg/kg，將硫唑嘌呤和生理鹽水配制成濃度為0.2mg/mL 的溶液，灌胃體積10mL/kg）灌胃；陰性對照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，每天1 次，持續(xù)給予5 天。

1.4 血清ALT和AST 水平測定 末次灌胃24h 后眼靜脈取血，離心（轉(zhuǎn)速4500r/min，離心半徑10cm）10min，分離血清，采用全自動生化分析儀酶法檢測血清ALT和AST 水平。

1.5 HE 染色觀察小鼠肝臟病理改變 末次灌胃24h 后，頸脫臼處死小鼠分離肝組織，將肝左葉用甲醛固定，其余肝組織液氮保存。肝左葉經(jīng)甲醛固定24h 后，進行脫水、包埋，切片厚度1μm，常規(guī)HE 染色，觀察肝組織病理學改變。

1.6 ELISA 法檢測肝組織IL-6和TNF-α 水平 取凍存肝組織，制成勻漿，將相應一抗稀釋至10μg/mL，加入到96 孔板中（0.1mL/孔），4℃過夜，洗滌3 次，加肝勻漿（0.1mL）于上述反應孔中，37℃孵育1h；加入新配置的相對應二抗0.1mL，孵育1h；加入新配置的3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物溶液（0.1mL），顯色（20min）；加入2mol/L 硫酸（0.05mL）終止反應，于450nm 處測各孔吸光度（A）值。

1.7 蛋白免疫印跡法檢測肝組織TRAF6、JNK、p-JNK、Bcl-2和Bax 水平 取凍存肝組織，制成勻漿，按1∶9 的比例加入RIPA 裂解液，冰浴2h，離心（轉(zhuǎn)速4500r/min，離心半徑10cm）10min 后取上清，每管加入1/5 體積的5×Buffer，100℃煮10min 進行變性，進行電泳（20μg/孔），將印跡轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，然后用5%脫脂牛奶在室溫下封膜1h，加入TRAF6、JNK、p-JNK、Bcl-2、Bax和β-actin 一抗（均為1∶500稀釋）4℃孵育過夜，用山羊抗鼠二抗（1∶5000）在室溫下孵育30min，進行顯色，采集圖像，通過Image LabTM 軟件獲取信號并估計強度，以β-actin 作為內(nèi)對照。

1.8 統(tǒng)計學方法 應用統(tǒng)計軟件SPSS 23.0 進行數(shù)據(jù)處理，實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步組間兩兩比較用SNK-q 檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血清ALT和AST 水平比較與陰性對照組比較，模型組小鼠血清ALT和AST 水平升高（P<0.05）；與模型組比較，柚皮素低、中、高劑量組和陽性對照組小鼠血清ALT和AST 水平降低，柚皮素各劑量組之間呈劑量效應關(guān)系（P<0.05）；柚皮素高劑量組與陽性對照組作用相似（P>0.05）。見表1。

表1 各組小鼠血清ALT和AST 水平比較（U/L，±s）

注：陰性對照組灌胃生理鹽水；模型組灌胃生理鹽水；柚皮素低劑量組灌胃30mg/kg 柚皮素；柚皮素中劑量組灌胃60mg/kg 柚皮素；柚皮素高劑量組灌胃120mg/kg 柚皮素；陽性對照組灌胃2mg/kg 硫唑嘌呤；ALT 為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；AST 為天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；與陰性對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與柚皮素低劑量組比較，cP＜0.05；與柚皮素中劑量組比較，dP＜0.05

2.2 各組小鼠肝臟病理改變比較 陰性對照組小鼠肝臟結(jié)構(gòu)未見明顯異常；模型組小鼠見大片肝細胞壞死，肝索排列紊亂，同時伴有炎性細胞浸潤；柚皮素各劑量組和陽性對照組病理改變較模型組減輕，且柚皮素高劑量組與陽性對照組只存在輕度肝細胞壞死。見圖1。

圖1 各組小鼠肝臟病理圖（HE 染色×200）

2.3 各組小鼠肝組織IL-6和TNF-α 水平比較與陰性對照組比較，模型組小鼠肝組織IL-6和TNF-α水平升高（P<0.05）；與模型組比較，柚皮素低、中、高劑量組和陽性對照組小鼠肝組織IL-6和TNF-α 水平降低，柚皮素各劑量組之間呈劑量效應關(guān)系（P<0.05）；柚皮素高劑量組與陽性對照組作用相似（P>0.05）。見表2。

表2 各組小鼠肝組織IL-6和TNF-α 水平比較（pg/mL，±s）

表2 各組小鼠肝組織IL-6和TNF-α 水平比較（pg/mL，±s）

注：陰性對照組灌胃生理鹽水；模型組灌胃生理鹽水；柚皮素低劑量組灌胃30mg/kg 柚皮素；柚皮素中劑量組灌胃60mg/kg 柚皮素；柚皮素高劑量組灌胃120mg/kg 柚皮素；陽性對照組灌胃2mg/kg 硫唑嘌呤；IL-6 為白細胞介素-6；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；與陰性對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與柚皮素低劑量組比較，cP＜0.05；與柚皮素中劑量組比較，dP＜0.05

2.4 各組小鼠肝組織TRAF6、JNK和p-JNK 蛋白水平比較 各組小鼠肝組織JNK 蛋白水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與陰性對照組比較，模型組小鼠肝組織TRAF6和p-JNK 蛋白水平增加（P<0.05）；與模型組比較，柚皮素低、中、高劑量組和陽性對照組小鼠肝組織TRAF6和p-JNK 蛋白水平降低，柚皮素各劑量組之間呈劑量效應關(guān)系（P<0.05）；柚皮素高劑量組與陽性對照組作用相似（P>0.05）。見表3、圖2。

圖2 各組小鼠肝組織TRAF6、JNK和p-JNK 蛋白表達印跡圖

表3 各組小鼠肝組織TRAF6、JNK和p-JNK 蛋白水平比較（±s）

表3 各組小鼠肝組織TRAF6、JNK和p-JNK 蛋白水平比較（±s）

注：陰性對照組灌胃生理鹽水；模型組灌胃生理鹽水；柚皮素低劑量組灌胃30mg/kg 柚皮素；柚皮素中劑量組灌胃60mg/kg 柚皮素；柚皮素高劑量組灌胃120mg/kg 柚皮素；陽性對照組灌胃2mg/kg 硫唑嘌呤；TRAF6 為腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6；JNK 為c-Jun 氨基末端激酶；p-JNK 為磷酸化c-Jun 氨基末端激酶；與陰性對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與柚皮素低劑量組比較，cP＜0.05；與柚皮素中劑量組比較，dP＜0.05

2.5 各組小鼠肝組織Bcl-2和Bax 蛋白水平比較與陰性對照組比較，模型組小鼠肝組織Bcl-2 蛋白和Bcl-2/Bax 水平降低，Bax 蛋白水平增加（P<0.05）；與模型組比較，柚皮素低、中、高劑量組和陽性對照組小鼠肝組織Bcl-2 蛋白和Bcl-2/Bax 水平增加，Bax 蛋白水平降低，柚皮素各劑量組之間呈劑量效應關(guān)系，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；柚皮素高劑量組與陽性對照組作用相似（P>0.05）。見表4、圖3。

表4 各組小鼠肝組織Bcl-2和Bax 蛋白水平比較（±s）

表4 各組小鼠肝組織Bcl-2和Bax 蛋白水平比較（±s）

注：陰性對照組灌胃生理鹽水；模型組灌胃生理鹽水；柚皮素低劑量組灌胃30mg/kg 柚皮素；柚皮素中劑量組灌胃60mg/kg 柚皮素；柚皮素高劑量組灌胃120mg/kg 柚皮素；陽性對照組灌胃2mg/kg 硫唑嘌呤；Bcl-2 為B細胞淋巴瘤/白血病-2；Bax 為B細胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X 蛋白；與陰性對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與柚皮素低劑量組比較，cP＜0.05；與柚皮素中劑量組比較，dP＜0.05

圖3 各組小鼠肝組織Bcl-2和Bax 蛋白表達印跡圖

3 討論

柚皮素是一種草藥提取物，具有顯著的抗炎和抗氧化活性，已有研究證明柚皮素對肝損傷具有保護作用，通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，發(fā)揮抗肝細胞凋亡作用[11]。同時，柚皮素通過阻止NADPH 氧化酶1（Nox1）蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，對膽總管結(jié)扎（BDL）誘導的肝損傷具有炎癥抑制作用[8]。

AIH 的發(fā)病主要是由于免疫調(diào)節(jié)功能紊亂，免疫系統(tǒng)以肝臟自身抗原為靶點，引起不可控制的免疫反應，從而導致肝臟持續(xù)損傷，而炎癥是肝細胞損傷的重要機制之一[12]，炎性細胞因子（TNF-α、IFN-γ和IL-6）在ConA 致肝損傷的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[13]。肝細胞損傷后，ALT和AST 均被釋放，這些標記物被廣泛用于肝損傷檢測[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠血清ALT、AST和肝組織IL-6、TNF-α 水平高于陰性對照組，柚皮素低、中、高劑量組小鼠血清ALT、AST和肝組織TNF-α和IL-6 水平低于模型組。組織病理學證據(jù)也表明，柚皮素各劑量組小鼠肝臟炎癥和肝細胞壞死明顯減輕。因此，柚皮素在ConA 誘導的炎癥性肝損傷中起著明顯的抗炎作用。

TRAF6 是一種細胞質(zhì)銜接蛋白，在哺乳動物組織中廣泛表達，被認為是許多具有免疫調(diào)節(jié)功能的受體家族的下游因子，可以激活多種信號傳導途徑，包括JNK 途徑[15]。TRAF6 的表達與癌癥和自身免疫性疾病等多種疾病密切相關(guān)。通過抑制TRAF6 的表達，可以有效減輕肝臟損傷[16]。此外，TRAF6 敲低可阻斷Toll 樣受體4（TLR4）誘導的JNK 磷酸化[17]。TRAF6/JNK信號傳導是許多系統(tǒng)疾病的關(guān)鍵潛在機制之一。p-JNK 是JNK 的活性形式，在ConA 注射后產(chǎn)生p-JNK，并轉(zhuǎn)移到核膜或線粒體膜上，引起肝臟損害[18]。凋亡對于炎癥相關(guān)的肝病至關(guān)重要，可由內(nèi)源性或外源性因素誘導。p-JNK 可以轉(zhuǎn)運至線粒體膜，使Bcl-2 失活，導致細胞色素C（Cyt C）的釋放，啟動半胱氨酸蛋白酶（caspases）介導的凋亡[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠肝組織TRAF6、p-JNK和Bax 蛋白水平高于陰性對照組，Bcl-2 蛋白和Bcl-2/Bax 水平低于陰性對照組；柚皮素低、中、高劑量組小鼠肝組織TRAF6、p-JNK和Bax 蛋白水平低于模型組，Bcl-2 蛋白和Bcl-2/Bax 水平高于模型組。提示柚皮素可能通過抑制TRAF6 的表達，從而抑制JNK 的磷酸化，抑制肝細胞凋亡，減輕ConA 誘導的肝損傷。

綜上所述，柚皮素可能通過抑制TRAF6/JNK信號通路，減輕AIH 模型小鼠肝臟炎癥反應，抑制肝細胞凋亡，發(fā)揮肝臟保護作用，可能是治療AIH 的潛在治療藥物，但其臨床應用仍需大量研究來論證。