陳虹，周俗，劉剛，王鈺，康曉慧

(1.四川省草原科學(xué)研究院，青藏高原高寒草地生態(tài)修復(fù)工程技術(shù)研究中心，四川 成都 611731；2.西南科技大學(xué)，四川 綿陽 621000)

我國黑麥草種植面積大，以南方種植更為普遍[1]。黑麥草屬于禾本科黑麥屬(Lolium)，多年生或一年生草本植物，耐寒性較強(qiáng)，生長發(fā)育速度快，品質(zhì)優(yōu)良，在輪作系統(tǒng)中，黑麥草常與青貯玉米進(jìn)行輪作。在秋冬季種植黑麥草，不僅能夠減少土地資源的浪費(fèi)，還能在冬春季節(jié)為畜牧業(yè)提供優(yōu)質(zhì)的青綠飼草，解決冬季畜牧業(yè)缺少青綠飼料和冬季田地荒廢的問題，進(jìn)而提高農(nóng)牧民的收益，促進(jìn)畜牧業(yè)的發(fā)展[2]。黑麥草真菌性病害病原菌主要有銹菌(Pucciniastriiformis)、鐮刀菌(Fusariumpoae)、禾草離孺孢(Bipolarissorokiniana)和灰梨孢(Pyriculariagrisea)等[3-7]，該病害常常會(huì)造成黑麥草減產(chǎn)并影響黑麥草營養(yǎng)品質(zhì)?；依骀咴斐傻幕野卟∈軠囟群蜐穸扔绊懽畲?，高溫高濕，雨、霧、露存在的天氣均有利于發(fā)病。氣溫在20～30℃，陰雨天多，相對(duì)濕度保持在90%以上，容易引起該病嚴(yán)重發(fā)生。黑麥草感病初期，葉片呈水浸狀的微傷,而后變成壞死狀斑點(diǎn)，并且葉片上的斑點(diǎn)會(huì)迅速擴(kuò)大，發(fā)展成灰褐色、紡錘形病斑。病斑中部灰色或灰褐色，邊緣紫褐色，病斑周圍一圈呈黃色枯萎狀[8-14]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，黑麥草灰梨孢灰斑病在四川發(fā)生較為普遍，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致黑麥草整株枯萎死亡。薛福祥[8]、張家齊等[9]研究表明，黑麥草在高溫高濕條件下，可導(dǎo)致90%以上植株死亡，而國內(nèi)外灰梨孢灰斑病相關(guān)文獻(xiàn)較少，對(duì)于不同品種的黑麥草種質(zhì)評(píng)價(jià)方面的研究不多。本研究通過研究盆栽條件下接種灰梨孢灰斑病菌[15]后的發(fā)病情況，分析四川主要栽培的黑麥草不同品種的抗病性并進(jìn)行評(píng)價(jià)[16-18]，為選育抗病品種及綠色防控提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

病葉采集：2018年10月于成都市大邑縣韓場(chǎng)鎮(zhèn)采集處于分蘗期的黑麥草灰梨孢灰斑病病葉，裝入密封袋編號(hào)保存。

試驗(yàn)采用塑料花盆(底部開孔，盆底直徑175 mm，盆口直徑235 mm，盆高200 mm)，盆栽用土為通用型有機(jī)營養(yǎng)土(已經(jīng)過高溫殺菌)。

供試黑麥草品種中多年生黑麥草(Loliumperenne)4個(gè)品種，分別為維多利亞、紳士、首相、紐怡；一年生黑麥草(Loliummultiflorum)6個(gè)品種，分別為安第斯、長江2號(hào)、杰威、普通、安格斯1號(hào)、川農(nóng)1號(hào)。播種前進(jìn)行發(fā)芽率測(cè)試，10個(gè)品種種子質(zhì)量符合試驗(yàn)要求，詳見表1。

表1 參試品種及來源

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 病原菌制備 根據(jù)柯赫氏法則，分離純化采集到的疑似黑麥草灰梨孢灰斑病病葉上的病原物，鑒定病原菌為灰梨孢灰斑病菌。將得到的病原菌接種至正常黑麥草植株上，發(fā)病后表現(xiàn)出同樣的水漬狀病斑，將發(fā)病葉片重新分離獲得與之前接種一致的病原菌。將純化后的灰梨孢灰斑病病原菌保存于-4℃低溫培養(yǎng)箱中備用。

1.2.2 土壤最大持水量測(cè)定 將裝有滅菌土壤(每個(gè)塑料盆裝取滅菌土壤2 500 g)的花盆放置于托盤中，反復(fù)均勻地向花盆中澆水，直至花盆底部流出的水與托盤口同高。然后將花盆口用塑料薄膜封住，共設(shè)置3個(gè)重復(fù)。放置24 h后，將花盆從托盤中取出，擦去花盆表面的水分后稱重，得到總重(W1)。再將花盆放置于80℃烘箱中烘干24 h，反復(fù)稱量至重量不再變化時(shí)記錄干重(W2)。根據(jù)公式W=W1-W2計(jì)算土壤最大持水量，本試驗(yàn)中每盆土壤平均最大持水量為980 g。

1.2.3 盆栽植苗 參照《一年生黑麥草主要病害綠色防控技術(shù)規(guī)程DB51/T 2452-2018》和《多年生黑麥草牧草生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程DB51/T 399-2004》，將黑麥草種子均勻撒播在準(zhǔn)備好的塑料花盆里，設(shè)置接菌和不接菌處理，接菌處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，共設(shè)置盆栽(3+1)×10個(gè)。待黑麥草種子萌發(fā)一周后，將每盆黑麥草處理至株數(shù)均勻、間距合理，每盆黑麥草數(shù)量大約為50株，整個(gè)培養(yǎng)期間保持無雜草生長，調(diào)節(jié)土壤中含水量為土壤最大持水量的70%。

1.2.4 接種方法 9月22日下種，黑麥草植株自然生長至第5周(10月28日)開始接菌。接菌采用孢子懸浮液涂抹法，將灰梨孢灰斑病菌用PDA培養(yǎng)基密封培養(yǎng)3周，刮下孢子制成孢子懸浮液，用紗布涂抹于葉片表面。之后，將透明塑料薄膜覆蓋于盆栽上1周，從接種灰梨孢灰斑病病菌開始，測(cè)定記錄環(huán)境中溫濕度(USB型溫濕記錄儀，型號(hào)為Cos-3)，控制接菌后1周內(nèi)的相對(duì)濕度為75%以上。每天定期觀察、澆水，保持盆栽內(nèi)環(huán)境濕度(圖1)。

圖1 盆栽環(huán)境Fig.1 The environment of pot cultivation

1.2.5 發(fā)病情況調(diào)查 接菌后出現(xiàn)病情即開始調(diào)查，此后每3天調(diào)查一次，共調(diào)查4次。每盆隨機(jī)抽取10株，記錄發(fā)病株數(shù)和嚴(yán)重度，計(jì)算發(fā)病率、平均嚴(yán)重度和病情指數(shù)，計(jì)算公式如下：

發(fā)病率=[病株(器官、葉)數(shù)/調(diào)查總株(器官、葉)數(shù)]×100%

平均嚴(yán)重度=[∑(分級(jí)數(shù)值×病葉數(shù))/總病葉數(shù))]×100%

病情指數(shù)=發(fā)病率×平均嚴(yán)重度×100

1.2.6 病情分級(jí) 采用病級(jí)分類和系統(tǒng)聚類分析方法對(duì)黑麥草進(jìn)行抗病性評(píng)價(jià)，參照南志標(biāo)[17]、陳秀蓉[18](2003)的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其嚴(yán)重度進(jìn)行分級(jí)。0級(jí)，無癥狀；1級(jí)，病斑面積≤5%；2級(jí)，病斑面積6%～20%；3 級(jí)，病斑面積21%～40%；4級(jí)，病斑面積41%～70%；5級(jí)，病斑面積≥71%。待獲得若干樣本的嚴(yán)重度數(shù)值后，采用加權(quán)平均法計(jì)算出平均嚴(yán)重度。

參照文克儉[19]的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)各品種病情指數(shù)對(duì)其抗病性進(jìn)行分級(jí)?？剐栽u(píng)價(jià)分為4級(jí)：高抗(HR)：病情指數(shù)為0～5；中抗(MR)：病情指數(shù)為5.01～25；中感(MS)：病情指數(shù)為25.01～40；高感(HS)：病情指數(shù)為40.01～100。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 用EXCEL 2016對(duì)發(fā)病率、平均嚴(yán)重度和病情指數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)處理，用SPSS 25.0對(duì)黑麥草灰梨孢灰斑病病情指數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和鄧肯(Duncan)法多重比較檢驗(yàn)各處理間的差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病過程

接種病原菌后，環(huán)境溫度最高為33.2℃，最低為12℃，并且前3 d變化較為明顯，之后趨于緩和(圖2)。接種環(huán)境相對(duì)濕度滿足病原菌萌發(fā)條件，從第3 d起，一年生黑麥草安第斯、普通、安格斯1號(hào)、川農(nóng)1號(hào)出現(xiàn)葉部病斑，發(fā)病率均為10%以上，而長江2號(hào)、杰威未出現(xiàn)病斑；多年生黑麥草首相、維多利亞、紳士、紐怡發(fā)病率僅為1%。一年生黑麥草安第斯、普通、安格斯1號(hào)、川農(nóng)1號(hào)病斑面積迅速擴(kuò)大，全株染病。發(fā)病后期，川農(nóng)1號(hào)、安格斯1號(hào)和安第斯受灰梨孢灰斑病影響導(dǎo)致整株枯萎狀死亡(圖3)。

圖2 盆栽外環(huán)境溫度Fig.2 Ambient temperatures for plant growth

圖3 植株受侵染后枯萎狀死亡Fig.3 The plants withered and died after being infected注：圖為品種安格斯(a)和普通(b)

2.2 病原菌鑒定

對(duì)接種的灰梨孢灰斑病進(jìn)行病原菌分離純化后，挑取部分菌絲于顯微鏡下觀察鑒定，分生孢子梗單生或叢生，多不分枝，頂部屈膝，淡褐色，表面光滑，(60～200) μm×(3.5～5.5) μm；產(chǎn)孢細(xì)胞多芽生，圓柱狀，合壁芽生產(chǎn)孢，合軸式延伸；分生孢子單生，洋梨形，無色至灰綠色，兩個(gè)隔膜，成熟時(shí)(21～31.5) μm×(7～10.5) μm，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征確定其為灰梨孢灰斑病菌(圖4)。

圖4 灰梨孢灰斑病病原菌分離鑒定Fig.4 Isolation and identification of Pyricularia grisea注：a：病斑；b：菌落；c：菌絲及孢子

2.3 發(fā)病率

接種后，10個(gè)黑麥草品種先后出現(xiàn)不同程度的發(fā)病。發(fā)病初期(接菌后第6 d)，一年生黑麥草川農(nóng)1號(hào)、安格斯1號(hào)、普通、安第斯發(fā)病率最為嚴(yán)重，顯著(P<0.05)高于其他黑麥草品種。多年生品種發(fā)病率較輕，其中，首相黑麥草發(fā)病率最輕，為11.7%。隨調(diào)查次數(shù)增加，每個(gè)品種的發(fā)病率均不斷增加，而川農(nóng)1號(hào)的發(fā)病率一直維持在較高水平。接菌后15 d時(shí)，川農(nóng)1號(hào)發(fā)病率最高，顯著高于其他品種黑麥草(P<0.05)?？傮w來看，多花黑麥草整體發(fā)病率較高，平均發(fā)病率為81.4%，從高到低依次是川農(nóng)1號(hào)96.7%>安格斯1號(hào)88.3%>安第斯86.7%>普通78.3%>長江2號(hào)71.7%>杰威66.7%；多年生黑麥草(維多利亞、紳士、首相、紐怡)整體發(fā)病率較低，平均發(fā)病率為24.6%，最高不超過30%(表2)。

表2 黑麥草品種發(fā)病率

2.4 嚴(yán)重度

通過對(duì)接菌后的黑麥草發(fā)病面積調(diào)查，可以得出，10個(gè)黑麥草品種發(fā)病初期的平均嚴(yán)重度均不高，但一年生黑麥草病情平均嚴(yán)重度較多年生黑麥草大(表3)。

表3 黑麥草品種對(duì)灰梨孢灰斑病的平均嚴(yán)重度分析

一年生黑麥草中，安格斯1號(hào)各階段平均嚴(yán)重度一直處于最高水平；多年生黑麥草整體病情嚴(yán)重度較低，各階段平均嚴(yán)重度均顯著(P<0.05)低于一年生黑麥草。綜合來看，一年生黑麥草安格斯1號(hào)、安第斯、川農(nóng)1號(hào)3個(gè)品種平均嚴(yán)重度無顯著差異(P<0.05)，但顯著(P<0.05)高于其他一年生黑麥草。從嚴(yán)重度級(jí)別來看，一年生黑麥草品種級(jí)別均在3級(jí)以上，且安格斯1號(hào)、安第斯、川農(nóng)1號(hào)為5級(jí)，發(fā)病面積最為嚴(yán)重；多年生黑麥草均為2級(jí)嚴(yán)重度以下，受病害影響較小。

2.5 病情指數(shù)分析與抗性表現(xiàn)

發(fā)病初期，普通品種黑麥草的病情指數(shù)最高，為15.2，顯著高于其他9個(gè)黑麥草品種(P<0.05)；隨調(diào)查次數(shù)增加，一年生黑麥草各階段病情指數(shù)均顯著(P<0.05)高于多年生黑麥草(表4)。其中，一年生黑麥草隨調(diào)查次數(shù)增加，川農(nóng)1號(hào)病情指數(shù)增長速度較其他5個(gè)品種快，在第15 d到達(dá)峰值，為79.7，顯著(P<0.05)高于其他5個(gè)多年黑麥草；多年生黑麥草品種中，隨發(fā)病時(shí)間延長，病情指數(shù)上升緩慢。

表4 黑麥草品種病情指數(shù)與抗性分析

按照抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分析，川農(nóng)1號(hào)、安格斯1號(hào)、安第斯、普通4個(gè)一年生黑麥草品種對(duì)灰梨孢灰斑病表現(xiàn)為高感(HS)，從發(fā)病初期到發(fā)病后期，4個(gè)品種的病情指數(shù)上升最快；杰威為中感(MS)，長江2號(hào)為中抗(MR)；紳士、首相、紐怡、維多利亞4個(gè)品種病情指數(shù)各階段均在5以下，達(dá)到高抗(HR)水平，病情指數(shù)隨調(diào)查時(shí)間的增加變化幅度小，4個(gè)品種之前的病情指數(shù)無顯著差異(P<0.05)。

3 討論

黑麥草灰梨孢灰斑病為近年來流行較廣的真菌性病害[20-21]，水稻稻瘟病病原菌同灰梨孢灰斑病病原菌同屬梨孢霉屬，兩者發(fā)病條件相似，均在高溫高濕環(huán)境下利于發(fā)病，各個(gè)部位均可發(fā)病[22-25]。薛福祥等[8]的研究表明，在濕度較高的環(huán)境下，植株被侵染后48 h便會(huì)迅速枯萎，3～5 d就可以導(dǎo)致易感黑麥草大田被毀滅殆盡，與本研究的情況一致。據(jù)調(diào)查，成都、綿陽、眉山、遂寧、資陽、南充等地區(qū)該病均有發(fā)生，一般是在播種后1個(gè)月時(shí)間內(nèi)嚴(yán)重發(fā)生，造成的損失非常巨大。因此，加強(qiáng)黑麥草灰梨孢灰斑病早期(一般是分蘗初期最佳)防控十分必要。多年生黑麥草的抗性較強(qiáng)，但多花黑麥草對(duì)灰梨孢灰斑病的抗性較差，原因可能是多花黑麥草前期的生長速度較快，營養(yǎng)體比較豐富，葉面積大，易于受到病害侵染，二者表現(xiàn)出明顯的抗性差異，應(yīng)在其致病機(jī)理上進(jìn)一步探討。

本次試驗(yàn)用平均嚴(yán)重度和病情指數(shù)兩個(gè)指標(biāo)對(duì)黑麥草灰梨孢灰斑病分別進(jìn)行抗性分級(jí)，其大多數(shù)結(jié)果大體一致，但對(duì)杰威、長江2號(hào)和普通3個(gè)品種有一些差異?；依骀呋野卟鞑パ杆伲：χ?，目前沒有針對(duì)性的評(píng)價(jià)方法和判斷指標(biāo)，而不同方法對(duì)黑麥草灰梨孢灰斑病抗性評(píng)價(jià)可能會(huì)出現(xiàn)偏差，會(huì)影響結(jié)果判斷，因此，在對(duì)梨孢霉屬真菌的抗性分級(jí)方法上應(yīng)做進(jìn)一步的有針對(duì)性的研討，為抗性選育和防治提供更為科學(xué)的依據(jù)。

本次試驗(yàn)為盆栽模擬性試驗(yàn)，可以為大田試驗(yàn)提供一定依據(jù)，其結(jié)果對(duì)生產(chǎn)上的防治具有積極的指導(dǎo)意義，在防治上應(yīng)優(yōu)先選用抗病品種，并加強(qiáng)做好早期防控。

本次試驗(yàn)為接菌試驗(yàn)，盆栽植物生長環(huán)境與大田有一定大的差異，其發(fā)病與大田植物自然發(fā)病情況應(yīng)有所不同，應(yīng)結(jié)合大田試驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)一步進(jìn)行效驗(yàn)完善。

4 結(jié)論

參試品種中多年生黑麥草維多利亞、紳士、首相、紐怡對(duì)灰梨孢灰斑病顯示出高抗(R)，且4個(gè)品種間無顯著差異，而多花黑麥草川農(nóng)1號(hào)、安格斯1號(hào)、安第斯對(duì)灰梨孢灰斑病顯示出高感(S)，3個(gè)品種差異不顯著。